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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR的可重复性
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hospitals

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR的可重复性 已有4人参与

最近，做实验出现了特别诡异的事件，之前PCR扩增很是顺利，中间出差一周后再换了新溶的引物，就怎么也扩不出来了。
这期间，DNA检测没有问题，浓度在27-30ng/ul之间，260/280值在1.7-1.9之间；稀释了DNA到10倍，50倍，100倍；引物是新的，别人也试过，引物没有问题；PCRmix也是新的，也换过牌子；换过PCR仪；换过操作的人.......
真是百思不得其解啊，望高人指点迷津啊，不甚感激！

此外，我在N篇文献上找到别人扩增的引物和PCR条件，引物都是通用的，结果用到自己的实验上就总是没有结果，实验一再的在重复重复，无望中~~~
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1楼 2013-11-29 09:57:14
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hospitals

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-29 14:23:21
模板是什么，gDNA？如何确定引物没有问题的？
文献上的PCR条件只能作为自己实验的参考，不要严格follow。PCR的条件在使用不同酶时会有少许差别。

对，模板是gDNA，先说一下PCR重复的问题就是之前能够成功扩增的，这应该能说明引物没有问题吧。现在同样的条件就是无法扩增，换过高保真酶，也无济于事。一开始考虑了模板降解问题，也重新提过DNA，都不行。
再就是第二个问题，同一个种的样品，有的可以个体能够扩增，而其他却怎么也扩不出来，再就是我用同样的模板扩过另外一个基因片段，都是线粒体上的，正常扩增，这说明模板和PCR药品都没问题的呀，真是头疼死了。
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9楼2013-12-01 21:52:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-30 22:32:33
模板是什么，gDNA？如何确定引物没有问题的？
文献上的PCR条件只能作为自己实验的参考，不要严格follow。PCR的条件在使用不同酶时会有少许差别。
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2楼2013-11-29 14:23:21
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)

海纳百川

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-30 22:32:38
我感觉一般的重复性是很好的 论坛里很多人重复自己以前的实验出了问题 还是自身找原因 试剂 样品 仪器
实在不行 去其他实验室做一下试试
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海纳百川止于至善
3楼2013-11-29 15:08:07
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换模板试一下说不定就行了
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借你一生好不好
4楼2013-11-29 19:36:35
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查看全部 28 个回答
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