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新虫 (初入文坛)

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[求助] PCR的可重复性已有4人参与

最近，做实验出现了特别诡异的事件，之前PCR扩增很是顺利，中间出差一周后再换了新溶的引物，就怎么也扩不出来了。
这期间，DNA检测没有问题，浓度在27-30ng/ul之间，260/280值在1.7-1.9之间；稀释了DNA到10倍，50倍，100倍；引物是新的，别人也试过，引物没有问题；PCRmix也是新的，也换过牌子；换过PCR仪；换过操作的人.......
真是百思不得其解啊，望高人指点迷津啊，不甚感激！

此外，我在N篇文献上找到别人扩增的引物和PCR条件，引物都是通用的，结果用到自己的实验上就总是没有结果，实验一再的在重复重复，无望中~~~

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1楼2013-11-29 09:57:14

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新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-29 14:23:21
模板是什么，gDNA？如何确定引物没有问题的？
文献上的PCR条件只能作为自己实验的参考，不要严格follow。PCR的条件在使用不同酶时会有少许差别。

对，模板是gDNA，先说一下PCR重复的问题就是之前能够成功扩增的，这应该能说明引物没有问题吧。现在同样的条件就是无法扩增，换过高保真酶，也无济于事。一开始考虑了模板降解问题，也重新提过DNA，都不行。
再就是第二个问题，同一个种的样品，有的可以个体能够扩增，而其他却怎么也扩不出来，再就是我用同样的模板扩过另外一个基因片段，都是线粒体上的，正常扩增，这说明模板和PCR药品都没问题的呀，真是头疼死了。