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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【新手求助】：pcr 条带弥散
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jannet0301

木虫 (小有名气)

ds

[求助] 【新手求助】：pcr 条带弥散

从土壤里提取的细菌总DNA，对16s 全长进行pcr

50μL体系：
模板：           5
正反引物：各1
exTaq酶：    0.25
dNTP:          4
buffer:         5
水：           33.75

条件：
94℃         45s
55℃         30s
72℃        90s   
  35个循环

体系和条件都是根据文献来的。
跑出来的图，有杂带弥散，求助！
大榭！
【新手求助】：pcr 条带弥散
2013-09-14_17-53-27_306.jpg

[ Last edited by jannet0301 on 2013-9-15 at 18:05 ]
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人生人不爱我我自爱
1楼 2013-09-15 18:04:22
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yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-17 14:47:37
酶不行，仔细看看文献里用的啥酶，多查几篇。一般会用两种酶扩增。第一次用非特异性不高的，第二次用特异性高的。
赞一下 回复此楼
Let'sdoit.
2楼2013-09-15 23:52:08
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一苇杭之xmc

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 23:56:34
看你的扩增产物亮度很亮啊。可以试试看降低体系中模板的量，我一般用2微升，并且可以讲模板稀释20,50,100倍，做一下梯度实验对比。或者就是降落pcr。这是我的经验。
赞一下 回复此楼
欲速则不达
3楼2013-10-29 21:56:33
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一苇杭之xmc

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

对啦，如果不做降落的话，还可以提高退火温度试试看。
赞一下 回复此楼
欲速则不达
4楼2013-10-29 21:58:04
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