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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR大片段问题
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lillian菲

银虫 (小有名气)

[求助] PCR大片段问题 已有2人参与

大家好，最近在p片段基因，大概有7500bp，因为需要做后续好多试验，需要PCR产物较多。之前PCR结果很好，最近p的结果总不理想。需要的条带在8000bp左右，但结果在6000bp的条带很亮，根本没法做胶回收，求大家帮忙解决，很急！
PCR大片段问题
360截图20130909163226089.jpg
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1楼 2013-09-09 16:33:27
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因为吃饭

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-09 20:15:50
产物的特异性不好，提高退火温度呢？
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lillian菲
辩证。
2楼2013-09-09 16:41:44
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
楼主用什么酶，扩这么大的片段？
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
3楼2013-09-09 21:41:22
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先考虑使用专一性高的DNA聚合酶。
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4楼2013-09-10 08:39:12
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lillian菲

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 因为吃饭 at 2013-09-09 16:41:44
产物的特异性不好，提高退火温度呢？

试过提高退火温度，还是有很多非特异性条带
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5楼2013-09-10 10:00:42
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lillian菲

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 南海所老龚 at 2013-09-09 21:41:22
楼主用什么酶，扩这么大的片段？

高保真酶啊
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6楼2013-09-10 10:01:02
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lillian菲

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-09-10 08:39:12
首先考虑使用专一性高的DNA聚合酶。

用的就是高保真的，以前有过好的结果，后来就不行了，很郁闷呢
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7楼2013-09-10 10:01:32
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yinl03

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-10 22:04:39
引物设计的长一点，适当提高退火温度，或者实在不行，分成2-3段P,然后用overlap拼接起来，这样也是个选择，总比停滞不前好啊！
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8楼2013-09-10 19:39:22
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hexia313

金虫 (小有名气)
分段P会好点

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2013-09-10 20:38:38
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liujianmin68

木虫 (职业作家)

努力发展交叉学科

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-30 22:15:40
gyesang: 回帖置顶 2013-09-30 22:15:41
根据你的情况，建议你用touch down PCR进行扩增，先用较高的退火温度扩增几个循环，然后在选择合适的退火温度。
如果上面的方法不凑效，你可以选择更好质量的酶进行扩增。比如: TOYOBO公司的KOD FX、TaKaRa公司的Tks Gflex DNA聚合酶，前面一种我用过，即使模板量很少，也能扩增出很亮的条带，而且非常适合长片段的扩增。后面的一种是我在宝生物网站上看到的，目前自己还没有使用过。
希望我说的这些对你有所帮助。
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转向地质微生物学
10楼2013-09-11 08:05:24
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