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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR大片段问题
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lillian菲

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by liujianmin68 at 2013-09-11 08:05:24
根据你的情况，建议你用touch down PCR进行扩增，先用较高的退火温度扩增几个循环，然后在选择合适的退火温度。
如果上面的方法不凑效，你可以选择更好质量的酶进行扩增。比如: TOYOBO公司的KOD FX、TaKaRa公司的T ...

谢谢了，我会尝试下的
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11楼2013-09-11 08:37:10
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议直接克隆，多挑几个测序。或者分段PCR。
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为什么
12楼2013-09-11 10:08:47
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cong.peiqian

金虫 (正式写手)

小研

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是引物放置时间过长导致的。
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不信天不信地，只信自己。
13楼2013-09-11 14:12:22
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

长片段PC不同于一般PCR的特殊要求：
1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)。

我今天的回答比过去的同类问题的回答要简便，应该更容易操作一些。
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14楼2014-07-08 01:57:04
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
更正：上贴的标题应为；“长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求”。
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15楼2014-07-08 02:02:29
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

你这个应该不难解决，设计引物温度高一点，用好点的酶，建议advantage 2

[ 发自小木虫客户端 ]
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16楼2014-07-08 12:31:54
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