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lillian菲

银虫 (小有名气)

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[求助] PCR大片段问题已有2人参与

大家好，最近在p片段基因，大概有7500bp，因为需要做后续好多试验，需要PCR产物较多。之前PCR结果很好，最近p的结果总不理想。需要的条带在8000bp左右，但结果在6000bp的条带很亮，根本没法做胶回收，求大家帮忙解决，很急！

360截图20130909163226089.jpg

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1楼 2013-09-09 16:33:27

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凌波丽

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【答案】应助回帖

长片段PC不同于一般PCR的特殊要求：
1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)。

我今天的回答比过去的同类问题的回答要简便，应该更容易操作一些。