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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR大片段问题
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lillian菲

银虫 (小有名气)

[求助] PCR大片段问题 已有2人参与

大家好，最近在p片段基因，大概有7500bp，因为需要做后续好多试验，需要PCR产物较多。之前PCR结果很好，最近p的结果总不理想。需要的条带在8000bp左右，但结果在6000bp的条带很亮，根本没法做胶回收，求大家帮忙解决，很急！
PCR大片段问题
360截图20130909163226089.jpg
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1楼 2013-09-09 16:33:27
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lillian菲

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 因为吃饭 at 2013-09-09 16:41:44
产物的特异性不好，提高退火温度呢？

试过提高退火温度，还是有很多非特异性条带
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5楼2013-09-10 10:00:42
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lillian菲

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 南海所老龚 at 2013-09-09 21:41:22
楼主用什么酶，扩这么大的片段？

高保真酶啊
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6楼2013-09-10 10:01:02
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lillian菲

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-09-10 08:39:12
首先考虑使用专一性高的DNA聚合酶。

用的就是高保真的，以前有过好的结果，后来就不行了，很郁闷呢
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7楼2013-09-10 10:01:32
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lillian菲

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by liujianmin68 at 2013-09-11 08:05:24
根据你的情况，建议你用touch down PCR进行扩增，先用较高的退火温度扩增几个循环，然后在选择合适的退火温度。
如果上面的方法不凑效，你可以选择更好质量的酶进行扩增。比如: TOYOBO公司的KOD FX、TaKaRa公司的T ...

谢谢了，我会尝试下的
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11楼2013-09-11 08:37:10
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