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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR体系放大后无目的片段
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faile18

金虫 (小有名气)

[求助] PCR体系放大后无目的片段

昨天刚做了PCR克隆GFP基因的启动子，引物是自己设计的，10微升体系如下：
10*Buffer        1
MgCl2        1
dNTPs        0.2
L        0.2
R        0.2
Taq        1（实验室自己提取）
ddH2O        5.9
DNA        0.5（质粒DNA稀释1000倍）
上面的体系，可以扩增出目的片段，扩大体系至60微升之后，得不到任何产物，不知道问题会出在什么地方，请赐教。
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1楼 2012-05-04 11:30:21
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

karin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-04 13:59:39
PCR这种情况很常见，体系扩大后会使体系变得不稳定。如果你需要大量RCR产物的话，可以用原来的体系多做几管。我们一般都这样做，不会扩大体系。
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坚持就是胜利
3楼2012-05-04 12:40:03
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR仪一般都是金属导热的，体系大了肯定不是太好
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
8楼2012-05-09 08:14:56
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普通回帖

wushuwei1104

银虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-04 13:59:24
我们之前也做过这种实验，也遇到过这种情况。按常理说，这种情况不应该出现，但是具体分析原因的话，可能是小体系中某些物质浓度和你坐大体系时浓度不一样（可能是用枪吸的时候出现了差异），所以一般而言我们体系都不敢变化，原来做什么体系做出来了，今后也按这个体系做。要是更改体系的话，可能还要重新摸索条件！  呵呵，仅是个人观点，仅供参考！！  祝君好运！
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勤能补拙
2楼2012-05-04 12:34:43
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wushuwei1104 at 2012-05-04 12:34:43:
我们之前也做过这种实验，也遇到过这种情况。按常理说，这种情况不应该出现，但是具体分析原因的话，可能是小体系中某些物质浓度和你坐大体系时浓度不一样（可能是用枪吸的时候出现了差异），所以一般而言我们体系 ...

谢谢，之前别的实验的时候还是可以得到结果的，不知道这个是怎么了，再尝试一下吧，
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4楼2012-05-05 01:12:17
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by karin at 2012-05-04 12:40:03:
PCR这种情况很常见，体系扩大后会使体系变得不稳定。如果你需要大量RCR产物的话，可以用原来的体系多做几管。我们一般都这样做，不会扩大体系。

多做几管不担心某一管出现错配吗？
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5楼2012-05-05 01:13:13
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karin

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by faile18 at 2012-05-05 01:13:13:
多做几管不担心某一管出现错配吗？

不会啊，配好体系一般都不会错的。
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坚持就是胜利
6楼2012-05-05 08:12:16
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by karin at 2012-05-05 08:12:16:
不会啊，配好体系一般都不会错的。

我觉得说不准会有哪一管可能会出点问题，当然只是可能
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7楼2012-05-09 00:48:07
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by imyting at 2012-05-09 08:14:56:
PCR仪一般都是金属导热的，体系大了肯定不是太好

这个我以前做过放大体系的，从10微到80微，还是挺好的啊
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9楼2012-05-23 00:40:42
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冰岩8625

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以多做几个体系，试一下条件如，20、40微升，就可以知道什么原因了。一同一批次中，一般不会有某一管有问题吧~~~？？！！
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10楼2012-05-24 19:01:37
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