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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR体系放大后无目的片段
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冰岩8625

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以多做几个体系，试一下条件如，20、40微升，就可以知道什么原因了。一同一批次中，一般不会有某一管有问题吧~~~？？！！
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11楼2012-05-24 19:01:59
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冰岩8625

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以多做几个体系，试一下条件如，20、40微升，就可以知道什么原因了。一同一批次中，一般不会有某一管有问题吧~~~？？！！
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12楼2012-05-24 19:02:16
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冰岩8625

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以多做几个体系，试一下条件如，20、40微升，就可以知道什么原因了。一同一批次中，一般不会有某一管有问题吧~~~？？！！
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13楼2012-05-24 19:02:48
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q307078056

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by faile18 at 2012-05-05 01:13:13
多做几管不担心某一管出现错配吗？...

有很多办法确定你的技术性重复是否有误的呀..
譬如：PAGE电泳、荧光重复性..
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人生不是一种享受，而是一桩沉重异常的工作
14楼2013-04-21 08:47:17
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panyuzhu

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
15楼2013-04-21 10:19:57
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

还是PCR扩增的专一性问题
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。一般Mg2+离子浓度可以从1mmmol/L逐渐上升，到10mmmol/L就不要再高了，每次上升Mg2+离子浓度的梯度为1mmmol/L。　　
PCR循环条件和反应体积的改变：PCR循环25次也就差不多了，再往后可能扩增的专一性就不一定能保证了，高手除外。通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
引物：既然你过去都能成功，估计引物序列问题不大，但是要调整引物浓度和其与模板的结合温度。
总体上，最先检查模板质量和酶质量，再调Mg2+浓度，接着调引物浓度和其与模板的结合温度，再控制循环次数和反应体积，这些都不行，那就要重新设计引物。另外，考虑热启和加入少量BSA也有利于专一性PCR扩增。
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16楼2013-04-21 12:11:10
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