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冰岩8625

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以多做几个体系,试一下条件如,20、40微升,就可以知道什么原因了。一同一批次中,一般不会有某一管有问题吧~~~??!!
11楼2012-05-24 19:01:59
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冰岩8625

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以多做几个体系,试一下条件如,20、40微升,就可以知道什么原因了。一同一批次中,一般不会有某一管有问题吧~~~??!!
12楼2012-05-24 19:02:16
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冰岩8625

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以多做几个体系,试一下条件如,20、40微升,就可以知道什么原因了。一同一批次中,一般不会有某一管有问题吧~~~??!!
13楼2012-05-24 19:02:48
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q307078056

银虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by faile18 at 2012-05-05 01:13:13
多做几管不担心某一管出现错配吗?...

有很多办法确定你的技术性重复是否有误的呀..
譬如:PAGE电泳、荧光重复性..
人生不是一种享受,而是一桩沉重异常的工作
14楼2013-04-21 08:47:17
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panyuzhu

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

15楼2013-04-21 10:19:57
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

还是PCR扩增的专一性问题
Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特 异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。一般Mg2+离子浓度可以从1mmmol/L逐渐上升,到10mmmol/L就不要再高了,每次上升Mg2+离子浓度的梯度为1mmmol/L。  
PCR循环条件和反应体积的改变:PCR循环25次也就差不多了,再往后可能扩增的专一性就不一定能保证了,高手除外。通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul,应用多 大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。
引物:既然你过去都能成功,估计引物序列问题不大,但是要调整引物浓度和其与模板的结合温度。
总体上,最先检查模板质量和酶质量,再调Mg2+浓度,接着调引物浓度和其与模板的结合温度,再控制循环次数和反应体积,这些都不行,那就要重新设计引物。另外,考虑热启和加入少量BSA也有利于专一性PCR扩增。
16楼2013-04-21 12:11:10
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