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PCR体系放大后无目的片段
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昨天刚做了PCR克隆GFP基因的启动子，引物是自己设计的，10微升体系如下： 10*Buffer 1 MgCl2 1 dNTPs 0.2 L 0.2 R 0.2 Taq 1（实验室自己提取） ddH2O 5.9 DNA 0.5（质粒DNA稀释1000倍） 上面的体系，可以扩增出目的片段，扩大体系至60微升之后，得不到任何产物，不知道问题会出在什么地方，请赐教。 |
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【答案】应助回帖
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还是PCR扩增的专一性问题 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。一般Mg2+离子浓度可以从1mmmol/L逐渐上升，到10mmmol/L就不要再高了，每次上升Mg2+离子浓度的梯度为1mmmol/L。 PCR循环条件和反应体积的改变：PCR循环25次也就差不多了，再往后可能扩增的专一性就不一定能保证了，高手除外。通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 引物：既然你过去都能成功，估计引物序列问题不大，但是要调整引物浓度和其与模板的结合温度。 总体上，最先检查模板质量和酶质量，再调Mg2+浓度，接着调引物浓度和其与模板的结合温度，再控制循环次数和反应体积，这些都不行，那就要重新设计引物。另外，考虑热启和加入少量BSA也有利于专一性PCR扩增。 |
16楼2013-04-21 12:11:10
wushuwei1104
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2楼2012-05-04 12:34:43
karin
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3楼2012-05-04 12:40:03
4楼2012-05-05 01:12:17