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faile18

金虫 (小有名气)

[求助] PCR体系放大后无目的片段

昨天刚做了PCR克隆GFP基因的启动子,引物是自己设计的,10微升体系如下:
10*Buffer        1
MgCl2        1
dNTPs        0.2
L        0.2
R        0.2
Taq        1(实验室自己提取)
ddH2O        5.9
DNA        0.5(质粒DNA稀释1000倍)
上面的体系,可以扩增出目的片段,扩大体系至60微升之后,得不到任何产物,不知道问题会出在什么地方,请赐教。
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karin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-04 13:59:39
PCR这种情况很常见,体系扩大后会使体系变得不稳定。如果你需要大量RCR产物的话,可以用原来的体系多做几管。我们一般都这样做,不会扩大体系。
坚持就是胜利
3楼2012-05-04 12:40:03
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR仪一般都是金属导热的,体系大了肯定不是太好
悠哉游哉做实验,成兮败兮我随便
8楼2012-05-09 08:14:56
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普通回帖

wushuwei1104

银虫 (小有名气)

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-04 13:59:24
我们之前也做过这种实验,也遇到过这种情况。按常理说,这种情况不应该出现,但是具体分析原因的话,可能是小体系中某些物质浓度和你坐大体系时浓度不一样(可能是用枪吸的时候出现了差异),所以一般而言我们体系都不敢变化,原来做什么体系做出来了,今后也按这个体系做。要是更改体系的话,可能还要重新摸索条件!  呵呵,仅是个人观点,仅供参考!!  祝君好运!
勤能补拙
2楼2012-05-04 12:34:43
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faile18

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wushuwei1104 at 2012-05-04 12:34:43:
我们之前也做过这种实验,也遇到过这种情况。按常理说,这种情况不应该出现,但是具体分析原因的话,可能是小体系中某些物质浓度和你坐大体系时浓度不一样(可能是用枪吸的时候出现了差异),所以一般而言我们体系 ...

谢谢,之前别的实验的时候还是可以得到结果的,不知道这个是怎么了,再尝试一下吧,
4楼2012-05-05 01:12:17
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faile18

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by karin at 2012-05-04 12:40:03:
PCR这种情况很常见,体系扩大后会使体系变得不稳定。如果你需要大量RCR产物的话,可以用原来的体系多做几管。我们一般都这样做,不会扩大体系。

多做几管不担心某一管出现错配吗?
5楼2012-05-05 01:13:13
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karin

木虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by faile18 at 2012-05-05 01:13:13:
多做几管不担心某一管出现错配吗?

不会啊,配好体系一般都不会错的。
坚持就是胜利
6楼2012-05-05 08:12:16
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faile18

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by karin at 2012-05-05 08:12:16:
不会啊,配好体系一般都不会错的。

我觉得说不准会有哪一管可能会出点问题,当然只是可能
7楼2012-05-09 00:48:07
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faile18

金虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by imyting at 2012-05-09 08:14:56:
PCR仪一般都是金属导热的,体系大了肯定不是太好

这个我以前做过放大体系的,从10微到80微,还是挺好的啊
9楼2012-05-23 00:40:42
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冰岩8625

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以多做几个体系,试一下条件如,20、40微升,就可以知道什么原因了。一同一批次中,一般不会有某一管有问题吧~~~??!!
10楼2012-05-24 19:01:37
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