应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助——T载体连接转化出现问题了
251/3返回列表123下一页
查看: 2043  |  回复: 24
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

关包子

银虫 (小有名气)

[求助] 求助——T载体连接转化出现问题了

小弟最近做T载体连接转化问题，迟迟没有成功，这几天又做了一次，还是没有出成果，希望各位前辈能够帮忙分析一下问题！
1、过程：
（1）首先PCR过程，我用的是one taq hot start 体系，并且扩充出来目的基因，基因长度约为700bp左右！
（2）胶回收用的是福记的试剂盒，回收了量管相同的基因，浓度分别是21ng/μL和18ng/μL，标记为T1、T2
（3）T载体连接用的是promega的试剂盒，载体是 T-easy，4度过夜连接
  （4）转化，用的感受态细胞是JM109

2、结果：
可是却出现了如下结果：
背景对照只有两个蓝斑
阳性对照也只有两个蓝斑
T1和T2都出现了大量的蓝斑没有白斑
这到底是什么原因呢？真的有点着急了！我已经卡在这个地方有将近一个月了！

[ Last edited by myprayer on 2013-7-24 at 16:56 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
为自己的梦想而努力
1楼 2013-07-24 08:56:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lillian菲

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-24 09:49:16
1.你做酶连体系是多少ul的？每个试剂都加了多少啊？有时候载体与目的片段的浓度不对也可能不成功的。
2.你确定你的感受态细胞是好的嘛？有木有做过验证试验或者转化时做个对照呢？
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

关包子
2楼2013-07-24 08:59:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-24 09:49:21
amisking: 回帖置顶 2013-07-24 20:27:57
首先，PCR产物应该是没问题的。你检查一下你的连接反应体系和转化步骤。个人经验，插入片段和载体比例要求并不严格。我觉得是你的连接酶效率不高，换新的连接酶试试。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

关包子
3楼2013-07-24 09:16:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

关包子

银虫 (小有名气)
送红花一朵
amisking: 回帖置顶 2013-07-24 20:28:03
引用回帖:
2楼: Originally posted by lillian菲 at 2013-07-24 08:59:58
1.你做酶连体系是多少ul的？每个试剂都加了多少啊？有时候载体与目的片段的浓度不对也可能不成功的。
2.你确定你的感受态细胞是好的嘛？有木有做过验证试验或者转化时做个对照呢？

连接体系是15μL，插入片段：载体=3:1

加样体系如下：
              T1            T2       阳性     背景
2xbuffer： 7.5         7.5       7.5       7.5

T-easy ：  1             1         1          1
(3kb,50ng/μL)

PCR 产物： 2           1.7        —         —
(18ng/μL,21ng/μL)
insert DNA：—         —         2          —

T4 ligase：  1           1          1          1

水        ： 3.5          3.8       3.5       5.5

感受态细胞JM109是自己制备的，最后检验是将自己分装的第一管和最后一管，导入pUC19，在amp培养基上过夜，都长出菌落，对照没有菌落，制备应该没问题！
赞一下 回复此楼
为自己的梦想而努力
4楼2013-07-24 10:11:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

关包子

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangweida2 at 2013-07-24 09:16:19
首先，PCR产物应该是没问题的。你检查一下你的连接反应体系和转化步骤。个人经验，插入片段和载体比例要求并不严格。我觉得是你的连接酶效率不高，换新的连接酶试试。

我用的是PROMEGA的 T4 ligase，新买的，应该没问题啊
赞一下 回复此楼
为自己的梦想而努力
5楼2013-07-24 10:12:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-24 12:09:26
引用回帖:
5楼: Originally posted by 关包子 at 2013-07-24 10:12:59
我用的是PROMEGA的 T4 ligase，新买的，应该没问题啊...

阳性对照正常应该有大量白斑，而你的只有两个蓝斑，所以你的连接反应可能有问题。但是呢，T1，T2又有大量蓝斑。如果没有污染的话这结果分析起来很是纠结。我建议是换连接酶试试，新买的不一定就没问题。
赞一下 回复此楼
6楼2013-07-24 11:16:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

关包子

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wangweida2 at 2013-07-24 11:16:38
阳性对照正常应该有大量白斑，而你的只有两个蓝斑，所以你的连接反应可能有问题。但是呢，T1，T2又有大量蓝斑。如果没有污染的话这结果分析起来很是纠结。我建议是换连接酶试试，新买的不一定就没问题。...

好的，我再换酶试一下，谢谢你哈
赞一下 回复此楼
为自己的梦想而努力
7楼2013-07-24 11:33:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

alicelchf

木虫 (著名写手)
★ ★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-24 12:09:36
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-07-24 18:37:16
引用回帖:
4楼: Originally posted by 关包子 at 2013-07-24 10:11:43
连接体系是15μL，插入片段：载体=3:1

加样体系如下：
              T1            T2       阳性     背景
2xbuffer： 7.5         7.5       7.5       7.5

T-easy ：  1             1         1     ...

感觉你的片段和载体的比例拉开的并不是很大。
所以你可以适当增加pcr产物的加入量，这样水就可以省去了
其实一直觉得水不是必须的，往往可以不加
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

关包子
修身、齐家、治国、平天下
8楼2013-07-24 11:52:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

光树林

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不是16度连接么(⊙o⊙)

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
一路向北
9楼2013-07-24 13:00:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hyphen007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同意楼上，连接不是16度吗？？？
赞一下 回复此楼
10楼2013-07-24 16:40:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 关包子 的主题更新
251/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +17 爱看书的可乐 2026-08-26 19/950 2026-08-30 15:09 by xiangy672
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 4/200 2026-08-30 14:05 by GkCVyODlx4mR
[基金申请] 国社科又开始会评了，不知道这次命运如何 +3 雨打竹帘 2026-08-30 4/200 2026-08-30 12:35 by 白大多亮
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 8/400 2026-08-30 12:03 by l0VvVHGBGRLv
[考博] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-30 11:10 by l0VvVHGBGRLv
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 10/500 2026-08-30 06:11 by ZPa0EcMwuECS
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-30 06:10 by ZPa0EcMwuECS
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 11/550 2026-08-30 06:00 by ZPa0EcMwuECS
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 8/400 2026-08-30 05:48 by ZPa0EcMwuECS
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +5 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 01:58 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +4 349506619 2026-08-28 4/200 2026-08-29 22:41 by alongwaytogo
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +9 苏东坡二世 2026-08-23 9/450 2026-08-29 14:41 by hustersqt
[基金申请] 申请删除本帖 +6 lyz123lyz 2026-08-27 7/350 2026-08-27 17:31 by 宁静致远sy
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +5 zhaosm1982 2026-08-27 6/300 2026-08-27 16:00 by lfy8008
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭