应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助——T载体连接转化出现问题了
251/3返回列表123下一页
查看: 2042  |  回复: 24
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

关包子

银虫 (小有名气)

[求助] 求助——T载体连接转化出现问题了

小弟最近做T载体连接转化问题，迟迟没有成功，这几天又做了一次，还是没有出成果，希望各位前辈能够帮忙分析一下问题！
1、过程：
（1）首先PCR过程，我用的是one taq hot start 体系，并且扩充出来目的基因，基因长度约为700bp左右！
（2）胶回收用的是福记的试剂盒，回收了量管相同的基因，浓度分别是21ng/μL和18ng/μL，标记为T1、T2
（3）T载体连接用的是promega的试剂盒，载体是 T-easy，4度过夜连接
  （4）转化，用的感受态细胞是JM109

2、结果：
可是却出现了如下结果：
背景对照只有两个蓝斑
阳性对照也只有两个蓝斑
T1和T2都出现了大量的蓝斑没有白斑
这到底是什么原因呢？真的有点着急了！我已经卡在这个地方有将近一个月了！

[ Last edited by myprayer on 2013-7-24 at 16:56 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
为自己的梦想而努力
1楼 2013-07-24 08:56:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有2个 )

wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-24 09:49:21
amisking: 回帖置顶 2013-07-24 20:27:57
首先，PCR产物应该是没问题的。你检查一下你的连接反应体系和转化步骤。个人经验，插入片段和载体比例要求并不严格。我觉得是你的连接酶效率不高，换新的连接酶试试。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

关包子
3楼2013-07-24 09:16:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

关包子

银虫 (小有名气)
送红花一朵
amisking: 回帖置顶 2013-07-24 20:28:03
引用回帖:
2楼: Originally posted by lillian菲 at 2013-07-24 08:59:58
1.你做酶连体系是多少ul的？每个试剂都加了多少啊？有时候载体与目的片段的浓度不对也可能不成功的。
2.你确定你的感受态细胞是好的嘛？有木有做过验证试验或者转化时做个对照呢？

连接体系是15μL，插入片段：载体=3:1

加样体系如下：
              T1            T2       阳性     背景
2xbuffer： 7.5         7.5       7.5       7.5

T-easy ：  1             1         1          1
(3kb,50ng/μL)

PCR 产物： 2           1.7        —         —
(18ng/μL,21ng/μL)
insert DNA：—         —         2          —

T4 ligase：  1           1          1          1

水        ： 3.5          3.8       3.5       5.5

感受态细胞JM109是自己制备的，最后检验是将自己分装的第一管和最后一管，导入pUC19，在amp培养基上过夜，都长出菌落，对照没有菌落，制备应该没问题！
赞一下 回复此楼
为自己的梦想而努力
4楼2013-07-24 10:11:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

lillian菲

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-24 09:49:16
1.你做酶连体系是多少ul的？每个试剂都加了多少啊？有时候载体与目的片段的浓度不对也可能不成功的。
2.你确定你的感受态细胞是好的嘛？有木有做过验证试验或者转化时做个对照呢？
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

关包子
2楼2013-07-24 08:59:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

关包子

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangweida2 at 2013-07-24 09:16:19
首先，PCR产物应该是没问题的。你检查一下你的连接反应体系和转化步骤。个人经验，插入片段和载体比例要求并不严格。我觉得是你的连接酶效率不高，换新的连接酶试试。

我用的是PROMEGA的 T4 ligase，新买的，应该没问题啊
赞一下 回复此楼
为自己的梦想而努力
5楼2013-07-24 10:12:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-24 12:09:26
引用回帖:
5楼: Originally posted by 关包子 at 2013-07-24 10:12:59
我用的是PROMEGA的 T4 ligase，新买的，应该没问题啊...

阳性对照正常应该有大量白斑，而你的只有两个蓝斑，所以你的连接反应可能有问题。但是呢，T1，T2又有大量蓝斑。如果没有污染的话这结果分析起来很是纠结。我建议是换连接酶试试，新买的不一定就没问题。
赞一下 回复此楼
6楼2013-07-24 11:16:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

关包子

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wangweida2 at 2013-07-24 11:16:38
阳性对照正常应该有大量白斑，而你的只有两个蓝斑，所以你的连接反应可能有问题。但是呢，T1，T2又有大量蓝斑。如果没有污染的话这结果分析起来很是纠结。我建议是换连接酶试试，新买的不一定就没问题。...

好的，我再换酶试一下，谢谢你哈
赞一下 回复此楼
为自己的梦想而努力
7楼2013-07-24 11:33:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

alicelchf

木虫 (著名写手)
★ ★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-24 12:09:36
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-07-24 18:37:16
引用回帖:
4楼: Originally posted by 关包子 at 2013-07-24 10:11:43
连接体系是15μL，插入片段：载体=3:1

加样体系如下：
              T1            T2       阳性     背景
2xbuffer： 7.5         7.5       7.5       7.5

T-easy ：  1             1         1     ...

感觉你的片段和载体的比例拉开的并不是很大。
所以你可以适当增加pcr产物的加入量，这样水就可以省去了
其实一直觉得水不是必须的，往往可以不加
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

关包子
修身、齐家、治国、平天下
8楼2013-07-24 11:52:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

光树林

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不是16度连接么(⊙o⊙)

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
一路向北
9楼2013-07-24 13:00:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hyphen007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同意楼上，连接不是16度吗？？？
赞一下 回复此楼
10楼2013-07-24 16:40:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 关包子 的主题更新
251/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +8 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-30 11:40 by l0VvVHGBGRLv
[公派出国] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 8/400 2026-08-30 11:32 by l0VvVHGBGRLv
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-30 11:19 by l0VvVHGBGRLv
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 G6APbkg8SA6w 2026-08-29 4/200 2026-08-30 07:39 by ZPa0EcMwuECS
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 G6APbkg8SA6w 2026-08-29 4/200 2026-08-30 07:17 by ZPa0EcMwuECS
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-30 06:10 by ZPa0EcMwuECS
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 4/200 2026-08-30 02:09 by ZPa0EcMwuECS
[博后之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 01:47 by ZPa0EcMwuECS
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 4/200 2026-08-30 01:45 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +15 晴天加油 2026-08-26 16/800 2026-08-29 18:28 by symmetry
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭