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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助——T载体连接转化出现问题了
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关包子

银虫 (小有名气)

[求助] 求助——T载体连接转化出现问题了

小弟最近做T载体连接转化问题，迟迟没有成功，这几天又做了一次，还是没有出成果，希望各位前辈能够帮忙分析一下问题！
1、过程：
（1）首先PCR过程，我用的是one taq hot start 体系，并且扩充出来目的基因，基因长度约为700bp左右！
（2）胶回收用的是福记的试剂盒，回收了量管相同的基因，浓度分别是21ng/μL和18ng/μL，标记为T1、T2
（3）T载体连接用的是promega的试剂盒，载体是 T-easy，4度过夜连接
  （4）转化，用的感受态细胞是JM109

2、结果：
可是却出现了如下结果：
背景对照只有两个蓝斑
阳性对照也只有两个蓝斑
T1和T2都出现了大量的蓝斑没有白斑
这到底是什么原因呢？真的有点着急了！我已经卡在这个地方有将近一个月了！

[ Last edited by myprayer on 2013-7-24 at 16:56 ]
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为自己的梦想而努力
1楼 2013-07-24 08:56:07
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wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-24 12:09:26
引用回帖:
5楼: Originally posted by 关包子 at 2013-07-24 10:12:59
我用的是PROMEGA的 T4 ligase，新买的，应该没问题啊...

阳性对照正常应该有大量白斑，而你的只有两个蓝斑，所以你的连接反应可能有问题。但是呢，T1，T2又有大量蓝斑。如果没有污染的话这结果分析起来很是纠结。我建议是换连接酶试试，新买的不一定就没问题。
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6楼2013-07-24 11:16:38
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lillian菲

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-24 09:49:16
1.你做酶连体系是多少ul的？每个试剂都加了多少啊？有时候载体与目的片段的浓度不对也可能不成功的。
2.你确定你的感受态细胞是好的嘛？有木有做过验证试验或者转化时做个对照呢？
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关包子
2楼2013-07-24 08:59:58
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wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-24 09:49:21
amisking: 回帖置顶 2013-07-24 20:27:57
首先，PCR产物应该是没问题的。你检查一下你的连接反应体系和转化步骤。个人经验，插入片段和载体比例要求并不严格。我觉得是你的连接酶效率不高，换新的连接酶试试。
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关包子
3楼2013-07-24 09:16:19
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关包子

银虫 (小有名气)
送红花一朵
amisking: 回帖置顶 2013-07-24 20:28:03
引用回帖:
2楼: Originally posted by lillian菲 at 2013-07-24 08:59:58
1.你做酶连体系是多少ul的？每个试剂都加了多少啊？有时候载体与目的片段的浓度不对也可能不成功的。
2.你确定你的感受态细胞是好的嘛？有木有做过验证试验或者转化时做个对照呢？

连接体系是15μL，插入片段：载体=3:1

加样体系如下：
              T1            T2       阳性     背景
2xbuffer： 7.5         7.5       7.5       7.5

T-easy ：  1             1         1          1
(3kb,50ng/μL)

PCR 产物： 2           1.7        —         —
(18ng/μL,21ng/μL)
insert DNA：—         —         2          —

T4 ligase：  1           1          1          1

水        ： 3.5          3.8       3.5       5.5

感受态细胞JM109是自己制备的，最后检验是将自己分装的第一管和最后一管，导入pUC19，在amp培养基上过夜，都长出菌落，对照没有菌落，制备应该没问题！
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为自己的梦想而努力
4楼2013-07-24 10:11:43
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