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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助——T载体连接转化出现问题了
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关包子

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
19楼: Originally posted by lixtong at 2013-07-25 14:33:10
首先，连接温度上，promega的官方说明书上写的很明白，最佳连接条件是4℃过夜连接，这楼主不用纠结。
其次，连接的话，体系尽量小点，这样连接时的效率要高一些。
第三，楼主有没有找一下培养基和X-gal、iptg的原 ...

谢谢兄弟啊！我和不同人都用promega的试剂盒做了一下，都是相同的结果：对照和样品全是蓝斑，菌落数都是样品大于对照！然后我用不同的TAKARA的做了一下，还是一样的结果！最后，我取蓝斑，做了个菌落pcr，有目的条带！真的是连上啦！我怀疑是不是我的x-gal浓度的问题，x-gal浓度是20mg/ul，却150ul倒入150ml固体LB，是不是浓度高啦？
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为自己的梦想而努力
21楼2013-07-28 08:34:51
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关包子

银虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by 王者归来001 at 2013-07-26 17:01:48
你要确定你PCR的产物是不是带有A尾巴，如果是高保真酶的话需要一步加A尾后才能连得上T载体

是biolab的one taq hot start系统，有polyA！后来菌落pcr检验，有目的条带，目的基因导入t载体中了！谢谢啊。不过我还是不知道为什么导进去了还是呈蓝斑！
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为自己的梦想而努力
22楼2013-07-28 08:37:16
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lixtong

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 关包子 at 2013-07-28 08:34:51
谢谢兄弟啊！我和不同人都用promega的试剂盒做了一下，都是相同的结果：对照和样品全是蓝斑，菌落数都是样品大于对照！然后我用不同的TAKARA的做了一下，还是一样的结果！最后，我取蓝斑，做了个菌落pcr，有目的条 ...

X-gal是20mg/ml吧？
另外，我们实验室都是取100ul的x-gal加入到20~25ml的固体培养基里面，感觉你的好像加少了，筛选效果效果不理想。
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23楼2013-07-28 10:27:51
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lloveyr

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 关包子 at 2013-07-24 18:03:33
第一条，最后一条都明白了，第二条不是太懂，体系大小还和连接成功与否有关联吗？...

体系太大，转化时如果都加入感受态中会有一定影响！
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24楼2013-07-30 09:39:46
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lloveyr

金虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 关包子 at 2013-07-28 08:37:16
是biolab的one taq hot start系统，有polyA！后来菌落pcr检验，有目的条带，目的基因导入t载体中了！谢谢啊。不过我还是不知道为什么导进去了还是呈蓝斑！...

这个问题我们很早就发现了，蓝白斑挑选这块几个公司的T载体都做的不是非常好，所以我们都不用蓝白斑筛选的，直接PCR鉴定。
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25楼2013-07-30 09:43:08
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