应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助——T载体连接转化出现问题了
252/3返回列表上一页123下一页
查看: 2103  |  回复: 24
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

lloveyr

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-24 18:37:28
4度连接，温度太低了。建议：1、加大PCR产物的用量，可以不加水，全部用PCR产物
                                         2、连接体系换用10ul或6ul（我们一般6ul），载体用0.5ul，连接酶0.5ul
                                         3、室温过夜连接，然后放入4度冰箱1小时以上再转化
T载体连接应该是非常简单的实验，你的目标片段又不长，应该是很容易连接成功的。我们按上述方法连接不用蓝白斑挑选，阳性转化率90%以上，建议你尝试，祝早日成功 ！
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

关包子
11楼2013-07-24 17:36:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

关包子

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by alicelchf at 2013-07-24 11:52:10
感觉你的片段和载体的比例拉开的并不是很大。
所以你可以适当增加pcr产物的加入量，这样水就可以省去了
其实一直觉得水不是必须的，往往可以不加...

嗯，promega上建议载体的比例是 3：1的，我是新手哈，这方面可能存在一些技巧，受教了！
赞一下 回复此楼
为自己的梦想而努力
12楼2013-07-24 17:59:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

关包子

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 光树林 at 2013-07-24 13:00:29
不是16度连接么(⊙o⊙)

4度也是可以的！要过夜连接！
赞一下 回复此楼
为自己的梦想而努力
13楼2013-07-24 17:59:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

关包子

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by hyphen007 at 2013-07-24 16:40:53
同意楼上，连接不是16度吗？？？

4度可以过夜连接的，这个试剂盒上有说明哈！
赞一下 回复此楼
为自己的梦想而努力
14楼2013-07-24 18:00:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

关包子

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by lloveyr at 2013-07-24 17:36:26
4度连接，温度太低了。建议：1、加大PCR产物的用量，可以不加水，全部用PCR产物
                                         2、连接体系换用10ul或6ul（我们一般6ul），载体用0.5ul，连接酶0.5ul
                ...

第一条，最后一条都明白了，第二条不是太懂，体系大小还和连接成功与否有关联吗？
赞一下 回复此楼
为自己的梦想而努力
15楼2013-07-24 18:03:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

alicelchf

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 光树林 at 2013-07-24 13:00:29
不是16度连接么(⊙o⊙)

说明书还有30度连接的呢
这个其实是16度过夜是常用的而已
赞一下 回复此楼
修身、齐家、治国、平天下
16楼2013-07-24 18:40:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

关包子

银虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by alicelchf at 2013-07-24 18:40:53
说明书还有30度连接的呢
这个其实是16度过夜是常用的而已...

好吧，温度这个真的是五花八门哈
赞一下 回复此楼
为自己的梦想而努力
17楼2013-07-24 19:52:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

关包子

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 光树林 at 2013-07-24 13:00:29
不是16度连接么(⊙o⊙)

TAKARA 是16度，promega是4度连接
赞一下 回复此楼
为自己的梦想而努力
18楼2013-07-25 10:17:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lixtong

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
关包子: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-07-28 08:37:45
首先，连接温度上，promega的官方说明书上写的很明白，最佳连接条件是4℃过夜连接，这楼主不用纠结。
其次，连接的话，体系尽量小点，这样连接时的效率要高一些。
第三，楼主有没有找一下培养基和X-gal、iptg的原因，是不是X-gal使用时浓度太高了？最好新配一下！
最后，楼主可以专门挑几个蓝色的做一下验证，我有一次做的时候挑了几个蓝色菌落也能连接上，试试吧！
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

关包子
19楼2013-07-25 14:33:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王者归来001

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你要确定你PCR的产物是不是带有A尾巴，如果是高保真酶的话需要一步加A尾后才能连得上T载体
赞一下 回复此楼
坚持不懈,终会成功!
20楼2013-07-26 17:01:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 关包子 的主题更新
252/3返回列表上一页123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +10 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 22/1100 2026-11-06 17:18 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:32 by 5sJFDKp2kwuI
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 14/700 2026-11-06 16:32 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:12 by 5sJFDKp2kwuI
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 12/600 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 14/700 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 14/700 2026-11-06 13:36 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 5/250 2026-11-06 09:01 by 2lRNluKrJpwL
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 12/600 2026-11-06 05:32 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 14/700 2026-11-06 05:11 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 kvewwGtKktqB 2026-11-04 16/800 2026-11-06 05:00 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-06 04:47 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 8/400 2026-11-06 02:24 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 7/350 2026-11-06 02:13 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 02:04 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 10/500 2026-11-06 01:51 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-06 01:42 by qL1cU46YIdK0
[基金申请] 各位基础老师们，看完中央《从严治党》的决定后，对学术界更加有信心了吧 +5 iaeyuan 2026-11-01 5/250 2026-11-04 14:43 by jinchengzi
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭