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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助——T载体连接转化出现问题了
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lloveyr

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-24 18:37:28
4度连接，温度太低了。建议：1、加大PCR产物的用量，可以不加水，全部用PCR产物
                                         2、连接体系换用10ul或6ul（我们一般6ul），载体用0.5ul，连接酶0.5ul
                                         3、室温过夜连接，然后放入4度冰箱1小时以上再转化
T载体连接应该是非常简单的实验，你的目标片段又不长，应该是很容易连接成功的。我们按上述方法连接不用蓝白斑挑选，阳性转化率90%以上，建议你尝试，祝早日成功 ！
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关包子
11楼2013-07-24 17:36:26
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关包子

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by alicelchf at 2013-07-24 11:52:10
感觉你的片段和载体的比例拉开的并不是很大。
所以你可以适当增加pcr产物的加入量，这样水就可以省去了
其实一直觉得水不是必须的，往往可以不加...

嗯，promega上建议载体的比例是 3：1的，我是新手哈，这方面可能存在一些技巧，受教了！
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为自己的梦想而努力
12楼2013-07-24 17:59:10
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关包子

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 光树林 at 2013-07-24 13:00:29
不是16度连接么(⊙o⊙)

4度也是可以的！要过夜连接！
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为自己的梦想而努力
13楼2013-07-24 17:59:41
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关包子

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by hyphen007 at 2013-07-24 16:40:53
同意楼上，连接不是16度吗？？？

4度可以过夜连接的，这个试剂盒上有说明哈！
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为自己的梦想而努力
14楼2013-07-24 18:00:32
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关包子

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by lloveyr at 2013-07-24 17:36:26
4度连接，温度太低了。建议：1、加大PCR产物的用量，可以不加水，全部用PCR产物
                                         2、连接体系换用10ul或6ul（我们一般6ul），载体用0.5ul，连接酶0.5ul
                ...

第一条，最后一条都明白了，第二条不是太懂，体系大小还和连接成功与否有关联吗？
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为自己的梦想而努力
15楼2013-07-24 18:03:33
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alicelchf

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 光树林 at 2013-07-24 13:00:29
不是16度连接么(⊙o⊙)

说明书还有30度连接的呢
这个其实是16度过夜是常用的而已
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修身、齐家、治国、平天下
16楼2013-07-24 18:40:53
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关包子

银虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by alicelchf at 2013-07-24 18:40:53
说明书还有30度连接的呢
这个其实是16度过夜是常用的而已...

好吧，温度这个真的是五花八门哈
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为自己的梦想而努力
17楼2013-07-24 19:52:36
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关包子

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 光树林 at 2013-07-24 13:00:29
不是16度连接么(⊙o⊙)

TAKARA 是16度，promega是4度连接
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为自己的梦想而努力
18楼2013-07-25 10:17:51
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lixtong

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
关包子: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-07-28 08:37:45
首先，连接温度上，promega的官方说明书上写的很明白，最佳连接条件是4℃过夜连接，这楼主不用纠结。
其次，连接的话，体系尽量小点，这样连接时的效率要高一些。
第三，楼主有没有找一下培养基和X-gal、iptg的原因，是不是X-gal使用时浓度太高了？最好新配一下！
最后，楼主可以专门挑几个蓝色的做一下验证，我有一次做的时候挑了几个蓝色菌落也能连接上，试试吧！
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关包子
19楼2013-07-25 14:33:10
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王者归来001

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你要确定你PCR的产物是不是带有A尾巴，如果是高保真酶的话需要一步加A尾后才能连得上T载体
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坚持不懈,终会成功!
20楼2013-07-26 17:01:48
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