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[求助]
求助——T载体连接转化出现问题了
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小弟最近做T载体连接转化问题，迟迟没有成功，这几天又做了一次，还是没有出成果，希望各位前辈能够帮忙分析一下问题！ 1、过程： （1）首先PCR过程，我用的是one taq hot start 体系，并且扩充出来目的基因，基因长度约为700bp左右！ （2）胶回收用的是福记的试剂盒，回收了量管相同的基因，浓度分别是21ng/μL和18ng/μL，标记为T1、T2 （3）T载体连接用的是promega的试剂盒，载体是 T-easy，4度过夜连接 （4）转化，用的感受态细胞是JM109 2、结果： 可是却出现了如下结果： 背景对照只有两个蓝斑 阳性对照也只有两个蓝斑 T1和T2都出现了大量的蓝斑没有白斑 这到底是什么原因呢？真的有点着急了！我已经卡在这个地方有将近一个月了！ [ Last edited by myprayer on 2013-7-24 at 16:56 ] |
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7楼2013-07-24 11:33:16
lillian菲
银虫 (小有名气)
- 应助: 22 (小学生)
- 金币: 1474.2
- 红花: 3
- 帖子: 74
- 在线: 29.3小时
- 虫号: 1642017
- 注册: 2012-02-25
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
2楼2013-07-24 08:59:58
3楼2013-07-24 09:16:19
送红花一朵amisking: 回帖置顶 2013-07-24 20:28:03
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连接体系是15μL，插入片段：载体=3:1 加样体系如下： T1 T2 阳性 背景 2xbuffer： 7.5 7.5 7.5 7.5 T-easy ： 1 1 1 1 (3kb,50ng/μL) PCR 产物： 2 1.7 — — (18ng/μL,21ng/μL) insert DNA：— — 2 — T4 ligase： 1 1 1 1 水 ： 3.5 3.8 3.5 5.5 感受态细胞JM109是自己制备的，最后检验是将自己分装的第一管和最后一管，导入pUC19，在amp培养基上过夜，都长出菌落，对照没有菌落，制备应该没问题！ |
4楼2013-07-24 10:11:43
