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左九年

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 851278
注册: 2009-09-18
性别: GG
专业: 微生物遗传育种学

[求助] PCR引物问题

求大神帮忙看一下我设计的这对引物可以用吗？
正向CTAAGCCCCGTA Tm 39.22 GC含量  58.33％
反向CGTGTCGCCTGC Tm48.86    GC含量75％

个人担心问题是：一引物长度12bp，是不是比较短啊？
                        二两个引物Tm值相差是不是比较大？
                        三反向引物GC含量是不是有点高啊？

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1楼 2013-05-27 09:52:41

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wulj513

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
左九年(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 02:01:30
gyesang: 回帖置顶 2013-05-29 02:01:34
左九年: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-05-29 19:35:15

你这一对引物不是很好。引物一般是18-27个碱基，常用20个碱基；然后就是你的正向引物退火温度太低，一般在45-60度最好；你的上下游引物的Tm值相差比较大，最好相近；你的反向引物GC含量太大了，一般在45%-55%；此外，引物不应有发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列；两引物间不应有大于4pb以上的互补序列或同源序列，在3’端不应有任何互补碱基。