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左九年

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR引物问题

求大神帮忙看一下我设计的这对引物可以用吗?
正向CTAAGCCCCGTA    Tm 39.22    GC含量  58.33%
反向CGTGTCGCCTGC    Tm48.86     GC含量75%

个人担心问题是:一 引物长度12bp,是不是比较短啊?
                           二 两个引物Tm值相差是不是比较大?
                           三 反向引物GC含量是不是有点高啊?
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

普通PCR引物一般在18bp以上,还是重新设计吧。
8楼2013-05-27 17:47:39
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
左九年(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-29 02:00:56
你自己分析的结果都是正确的,关键引物长度太短,建议长一点,TM值相差有点大,会影响扩增,理论上不相差两度
星陈代谢
2楼2013-05-27 10:29:52
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左九年

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kx444555 at 2013-05-27 10:29:52
你自己分析的结果都是正确的,关键引物长度太短,建议长一点,TM值相差有点大,会影响扩增,理论上不相差两度

我那个其实设计的是简并引物,只能找到四个相同且连续的氨基酸。引物长度实在不知道怎么加长了,就这个长度能扩增出来条带吗(不管结果是否单一)?
还有为了增加正向的退火温度,是不是可以在5端加几个A啊?如果正向的增加了几个A,反向的用不用增加几个改变一下长度啊?
3楼2013-05-27 10:54:12
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1 如果模板量较多,扩增应该没有问题 ;
2 可以的,也不要全加A,AGTC混合在一起就行
星陈代谢
4楼2013-05-27 11:33:38
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