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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR引物问题
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左九年

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR引物问题

求大神帮忙看一下我设计的这对引物可以用吗？
正向CTAAGCCCCGTA    Tm 39.22    GC含量  58.33％
反向CGTGTCGCCTGC    Tm48.86     GC含量75％

个人担心问题是：一 引物长度12bp，是不是比较短啊？
                           二 两个引物Tm值相差是不是比较大？
                           三 反向引物GC含量是不是有点高啊？
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1楼 2013-05-27 09:52:41
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左九年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by protura at 2013-05-28 08:31:42
引物确实比较短，但引物的好坏最终都要通过PCR来验证的。而且，楼主似乎对产物特异性也要求的不太高，可以一试。

我这么着扩增出来条带，哪怕有很多条带，总比我建文库筛选要来的简单的多吧，我先试试吧。
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10楼2013-05-28 08:47:16
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
左九年(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 02:00:56
你自己分析的结果都是正确的，关键引物长度太短，建议长一点，TM值相差有点大，会影响扩增，理论上不相差两度
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星陈代谢
2楼2013-05-27 10:29:52
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左九年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kx444555 at 2013-05-27 10:29:52
你自己分析的结果都是正确的，关键引物长度太短，建议长一点，TM值相差有点大，会影响扩增，理论上不相差两度

我那个其实设计的是简并引物，只能找到四个相同且连续的氨基酸。引物长度实在不知道怎么加长了，就这个长度能扩增出来条带吗（不管结果是否单一）？
还有为了增加正向的退火温度，是不是可以在5端加几个A啊？如果正向的增加了几个A，反向的用不用增加几个改变一下长度啊？
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3楼2013-05-27 10:54:12
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1 如果模板量较多，扩增应该没有问题 ；
2 可以的，也不要全加A，AGTC混合在一起就行
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星陈代谢
4楼2013-05-27 11:33:38
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