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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于双酶切作用时间
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不懂sophia

木虫 (初入文坛)

[求助] 关于双酶切作用时间

我要用BamHⅠ和 SphⅠ做双酶切，切质粒和PCR产物，请问80微升体系的加酶量是多少？需要作用多长时间？我试过两种酶各加2微升，处理8小时，但是还是没有切完全，请问是适当增加酶量还是延长酶切时间呢？
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1楼2013-05-16 22:34:51
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

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不懂sophia(myprayer代发): 金币+1, 感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-17 14:46:03
gyesang: 回帖置顶 2013-05-19 18:18:06
有个2楼搞什么不懂不要瞎说，10ul体系加入2ul酶已经20%的体系了，最终体系中含有的甘油10%严重影响酶切效果，一般酶切所加酶量是根据你的DNA量确定的，每种酶都有说明，1u在1h内可以酶切多少质粒DNA或基因组DNA，所以酶量与你的体系没有太大关系，大体系酶切的好处是可以降低你DNA中的杂质以及乙醇对酶的影响（稀释作用），如果你的酶8h还没有切开，这时候你需要考虑的是你DNA的问题，而不是酶切问题。一般所有的酶在1h内都可以切开质粒DNA.酶切翻译不是加入的酶越多越好，有时候恰恰相反。
祝好
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5楼2013-05-17 10:37:28
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光树林

木虫 (著名写手)

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不懂sophia(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-17 14:45:46
我一般10ul加入2ul的酶，楼主可以试试加入10ul 的酶。。。不过建议楼主缩小反应体系，50ul试试看，酶切8小时应该是足够的。还有你用的缓冲液是否对两种酶都适用
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一路向北
2楼2013-05-16 23:03:13
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
有些酶就是很难反应完全，割胶/去磷酸化接着做好了。
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3楼2013-05-16 23:47:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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不懂sophia(myprayer代发): 金币+1, 感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-17 14:45:54
这两个酶都挺好用的呀。酶的作用效果与底物的量有关，我一般是1μg质粒加10-15U(不是μl，是酶活单位)，切2-3小时。你的80μl酶切体系里加了多少μg质粒？此外，如果底物浓度太高也有可能造成酶切效果不好。
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4楼2013-05-17 08:44:10
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

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不懂sophia(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-17 14:46:11
我们一般都是4度过夜。绝对切得完全。如果你质粒切的不完全的话，你可以切完后再跑胶回收啊。我们一般是50ul的体系里面各加2ul的酶，30ul的DNA。
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keepon
6楼2013-05-17 14:11:18
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microblue

银虫 (小有名气)

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1. 大体系
2. 过夜酶切
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7楼2013-05-19 11:17:00
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waterstill

木虫 (小有名气)

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不懂sophia(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-19 18:18:21
切不好，和你DNA的质量，酶的质量都可能有关系；

DNA的质量：一定要减少杂质，简单点就是重新跑胶、切胶、回收，用pH8.0的Tri溶液（注意不是TE）溶解；

如果确定DNA没问题，那就换新酶，就是说有可能原来的酶被杂质污染了，失效！
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8楼2013-05-19 14:34:11
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waterstill

木虫 (小有名气)

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不懂sophia(gyesang代发): 金币+1, 适中最重要 2013-05-19 18:18:41
酶量不要增加了，时间也不可以太长，否则会切过头！
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9楼2013-05-19 14:36:39
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笑饮江湖水

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 光树林 at 2013-05-16 23:03:13
我一般10ul加入2ul的酶，楼主可以试试加入10ul 的酶。。。不过建议楼主缩小反应体系，50ul试试看，酶切8小时应该是足够的。还有你用的缓冲液是否对两种酶都适用

酶有点多了吧
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10楼2014-07-11 17:09:02
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