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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR电泳图求解
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北极星※

金虫 (小有名气)

[求助] PCR电泳图求解 已有1人参与

PCR后上样2.5ul，前8个孔为mix 引物  模板  水  中间八个为easy taq buffer dNTP 水 引物  前16个为相同引物，产物大小为392bp,后8个为easy taq  引物不同 不知道是什么原因导致P不出东西,求大家指点

2013-5-6 10PRMER.JPG

[ Last edited by gyesang on 2013-5-6 at 14:38 ]
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1楼 2013-05-06 14:14:14
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 应助指数+1, 真的很感激你。。。。。 2013-05-06 19:34:26
北极星※: 金币+1, ★有帮助, 给了很多方面建议 谢谢 2013-05-06 21:46:53
你的电泳基本上没有PCR产物的带出现。
　　
不出现扩增条带的可能原因如下：
　　　PCR反应的关键环节有(1)模板核酸的制备，(2)引物的质量与特异性,(3)酶的质量及活性 (4)PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
    模板：(1)模板中含有杂蛋白质，(2)模板中含有Taq酶抑制剂，(3)模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，(4)在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。(5)模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
　　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。商家提供的酶制剂可能含有甘油，可用透析或者超滤适当去除甘油成分。
    引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：(1)选定一个好的引物合成单位。(2)引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。(3)引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。(4)引物设计不合理，如引物长度不够，GC碱基少于40%，引物之间形成二聚体等。（5）引物一般20-30个碱基，至少要有18个碱基。（6）引物3’末端最好是G或C。
    Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。调节镁离子的浓度， 可由1.0mmol/L起以0.05mmol/L为单位逐渐上升，最高不超过10.0mmol/L。
    反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。可以使用石蜡隔离方式的热启动PCR。
    物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
　　　靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
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3楼2013-05-06 17:23:47
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chiden

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 应助指数+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-05-06 19:39:47
北极星※: 金币+1, ★★★很有帮助, 从实际出发 很感谢 2013-05-06 21:46:10
初看楼主的这个帖子内容介绍，额，有点没懂起楼主的描述意思是啥子
直接看图，貌似楼主的MARKER应该是2K plus，但是似乎没跑开，看起来很多条带的样子。
这就有点奇怪了哈，不晓得楼主是用的多少浓度的胶跑的。
在我们实验室跑胶跑了这样的距离看不出来条带有时候是正常现象
原因：
1.在跑胶的过程中样品会存在一定程度的弥散，而且楼主点样的样品量也比较小，这样的距离成像无带个人觉得实属正常。
2.根据楼主MARKER条带的位置来看，这个电泳的时间应该比较长，时间长样品也是会弥散的。
3.PCR未扩增成功，本来嘛，PCR这个东西有时候就是个运气的问题。

解决办法：
1.重新PCR扩增，多做几次总会有一次成功的。
2.进行梯度PCR，寻找最佳退火温度。个人觉得一出事情就觉得自己引物设计有问题是不明智的，毕竟重新设计引物到合成拿到手上至少4天以后，时间上就耽搁了，且不一定就真的是引物问题。
3.电泳检测时建议使用2.5%胶浓度。不晓得你们的电泳仪器是个啥子样子的，反正MARKER刚好跑开的时候成像是最好的，这个你可以自己解决的，避免时间过长。
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即使难过，也要微笑着走下去
4楼2013-05-06 18:44:02
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普通回帖

范儿

铜虫 (小有名气)
只看见引物二聚体，你marker是什么marker啊，这么多带
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说到不如做到，要做就做最好！
2楼2013-05-06 16:46:16
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chiden

木虫 (正式写手)
额，那个，本人是做植物的，不晓得楼主的样品来源哈，根据自己经验来的，说的不对不要见怪哈。。。。
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即使难过，也要微笑着走下去
5楼2013-05-06 18:45:58
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北极星※

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 范儿 at 2013-05-06 16:46:16
只看见引物二聚体，你marker是什么marker啊，这么多带

100bp maker
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6楼2013-05-06 21:38:24
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北极星※

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chiden at 2013-05-06 18:44:02
初看楼主的这个帖子内容介绍，额，有点没懂起楼主的描述意思是啥子
直接看图，貌似楼主的MARKER应该是2K plus，但是似乎没跑开，看起来很多条带的样子。
这就有点奇怪了哈，不晓得楼主是用的多少浓度的胶跑的。
...

1%的TAE maker100bp  最上面是1500bp 然后是1000bp 中间最亮的那是500bp,电泳150v 120mA 25min 我觉得是引物有问题 （放置4度时间比较长）退火温度已经是筛选过了的，今晚重新稀释下引物看怎样，做PCR只是想看看提取的DNA稀释后做模板状况怎么样，
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7楼2013-05-06 21:43:13
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北极星※

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by chiden at 2013-05-06 18:45:58
额，那个，本人是做植物的，不晓得楼主的样品来源哈，根据自己经验来的，说的不对不要见怪哈。。。。

非常感谢了  我是做海洋贝类的  多讨论么
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8楼2013-05-06 21:44:43
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
看不到图片
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9楼2013-05-10 16:26:32
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happybottle

新虫 (初入文坛)
偶也是来学习的，受教育了！
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10楼2013-05-10 20:09:51
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