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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒转化与表达
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

[求助] 质粒转化与表达

最近做一批重组质粒，测序正确。打算转rosetta和bl21做表达，然而经过好几次的折腾，就是一个菌不长。排除了感受态，抗性，质粒质量及操作过程中的问题，可是依然没能解决问题。我想问一下还有哪些可能的因素影响质粒的转化。还有一个问题，我做了一个NusA做融合伴侣的重组质粒，转化表达质粒成功后不表达，没有移码，用IPTG 0.5mM诱导3h，无任何表达。请大侠们帮忙看看到底是哪里出现了问题。
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1楼 2012-08-09 10:00:45
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无踪无影

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
aofeng860308: 金币+20, ★有帮助, 1 2012-08-09 21:50:22
小丹木木: 金币-19, 楼主收回多给的19个金币 2012-08-10 08:15:32
你这没长菌 会不会是菌被你涂板时候烫死了呢？
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一切皆有可能
2楼2012-08-09 15:24:24
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山轻水秀

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流！ 2012-08-09 19:50:31
aofeng860308: 回帖置顶 2012-08-09 21:50:47
1.你确定你说的那些都没问题吗，比如抗性，会不会加多了，几乎都杀死了。
2.“重组质粒，测序正确”是什么意思？你的质粒本身就是已经重组完的吗？还是说pcr产物序列正确？如果你经过连接的话，是不是你连接的比例有误？
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万变不离其宗，以明确的计划，灵活的方法，创造属于自己的天地
3楼2012-08-09 15:46:10
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无踪无影 at 2012-08-09 15:24:24
你这没长菌 会不会是菌被你涂板时候烫死了呢？

我很多时候不用涂布棒，直接摇匀的，也不长。
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4楼2012-08-09 21:44:52
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 山轻水秀 at 2012-08-09 15:46:10
1.你确定你说的那些都没问题吗，比如抗性，会不会加多了，几乎都杀死了。
2.“重组质粒，测序正确”是什么意思？你的质粒本身就是已经重组完的吗？还是说pcr产物序列正确？如果你经过连接的话，是不是你连接的比例 ...

抗性我做过10ug/ml,20ug/ml 50ug/ml还是没有长。
就是说我的质粒构建成功了，确定已经将目的片段装进了载体。但是表达不出来。
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5楼2012-08-09 21:49:10
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山轻水秀

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-08-09 21:49:10
抗性我做过10ug/ml,20ug/ml 50ug/ml还是没有长。
就是说我的质粒构建成功了，确定已经将目的片段装进了载体。但是表达不出来。...

我有一事不明，就是既然你载体表达不出来，那你怎么构建的？不也是经过转化最后提质粒得来的吗？
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万变不离其宗，以明确的计划，灵活的方法，创造属于自己的天地
6楼2012-08-10 07:31:37
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damaomao

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
7楼2012-08-10 09:47:39
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无踪无影

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-08-09 21:44:52
我很多时候不用涂布棒，直接摇匀的，也不长。...

哦  祝你好运
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一切皆有可能
8楼2012-08-10 11:13:10
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 山轻水秀 at 2012-08-10 07:31:37
我有一事不明，就是既然你载体表达不出来，那你怎么构建的？不也是经过转化最后提质粒得来的吗？...

开始我都是做连接转化的，转化效率有点低，都是长一个两个的，测序了下，这些长出来都是阳性的，等构建结束后进行表达的时候竟然没有表达。然后再做其他菌的转化就做不出来了！
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9楼2012-08-10 22:30:55
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by damaomao at 2012-08-10 09:47:39
确定转到rosetta和bl21里面了吗

确定，做了其他质粒的表达，没有问题。
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10楼2012-08-10 22:32:46
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