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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细胞稳定转染，质粒的设计
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susanuse

银虫 (小有名气)

[求助] 细胞稳定转染，质粒的设计

小女子最近刚接触质粒。想请问，以下问题：
1，我想让我的目的蛋白在细胞中表达的同时，同时表达GFP，在不表达目的蛋白时，不表达GFP，这样的质粒怎么设计？怎么选取质粒？或者用别的载体？？
2，目的蛋白在细胞中的总表达量不受改变。就是说在以后的刺激试验中，该增加蛋白表达的时候增加，该减小的时候减小，不受转染影响。
3，我希望能稳定转染，建立永久的细胞系。

有没有哪位大侠能帮我解答一下。没坐过分子克隆方面的试验，一窍不通。谢谢指导
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1楼2012-02-17 10:49:05
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回帖置顶 ( 共有1个 )

lder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

小丹木木(金币+5, MolEPI+1): 很热心哦 2012-02-20 10:21:06
第一个问题：构建共表达载体，将GFP基因与目标蛋白基因连接到同一个载体中，置于同一个启动子下。从理论上将这样可以保证两个基因的协同表达，通过检测GFP的表达量来预测目标蛋白的表达量。但是从实际经验上讲，即使在同一个启动子，也不能保证GFP与目标蛋白的表达量一致，通常而这的表达量会相差10倍甚至更多，这直接与基因的序列，表达效率有关。

第二个问题：你说的问题的实质是转化体基因组中目的基因的拷贝数稳定。拷贝数的多少及目的基因插入的位点决定了细胞中目的蛋白的表达量。只要目的基因插入的位点及拷贝数稳定了，你所说的问题也就解决了。而拷贝数及插入位点的稳定化，其实就是要建立稳定细胞系，因为稳定细胞系之所以稳定就是因为其目的基因的拷贝数及插入位点稳定。

第三个问题：建立稳定细胞系，就是要挑单克隆细胞了。使用电转化和脂质体转化可以提高稳定转化的效率，这两种方法的稳定转染效率最高，可以达到60-80%。转染之后的挑选单克隆可以使用有限稀释法和流式细胞仪分选法以及clonePIX FL 来做。有限稀释费事费力，基本是靠人力来做了，后两种方法有快多了，但是仪器昂贵多了。
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9楼2012-02-18 08:46:01
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c3024034

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
susanuse(金币+5): ★★★很有帮助 2012-02-17 12:54:33
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-18 08:08:26
把GFP与你的蛋白形成融合蛋白，构建质粒的时候把两个基因连一起，前一个去掉终止密码子。
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2楼2012-02-17 11:01:19
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
susanuse(金币+5): ★★★很有帮助 2012-02-17 12:54:40
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-17 13:43:42
楼上说的融合蛋白是一种方法。另外可以将两个基因（GFP和目的基因）在一个质粒中构建，分别用自己的启动子和终止子。

目的蛋白的表达量不受改变，要建立稳定的细胞株，大概耗时3-6个月的时间。还有你用的什么细胞有关。
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3楼2012-02-17 11:16:56
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susanuse

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by c3024034 at 2012-02-17 11:01:19:
把GFP与你的蛋白形成融合蛋白，构建质粒的时候把两个基因连一起，前一个去掉终止密码子。

请问大侠，那么把目的基因-GFP基因转入细胞以后会不会影响改蛋白在细胞中总的表达量？质粒又该怎么选呢？
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4楼2012-02-17 11:26:30
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susanuse

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 小周 at 2012-02-17 11:16:56:
楼上说的融合蛋白是一种方法。另外可以将两个基因（GFP和目的基因）在一个质粒中构建，分别用自己的启动子和终止子。

目的蛋白的表达量不受改变，要建立稳定的细胞株，大概耗时3-6个月的时间。还有你用的什么细 ...

大侠，请问如果质粒中分别用自己的启动子和终止子，能保证表达目的蛋白的时候就一定能表达GFP么？
我想用NMuMG细胞。
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5楼2012-02-17 11:28:34
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小周

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by susanuse at 2012-02-17 11:28:34:
大侠，请问如果质粒中分别用自己的启动子和终止子，能保证表达目的蛋白的时候就一定能表达GFP么？
我想用NMuMG细胞。

没有用过这个细胞，我接触的都是CHO，293细胞。瞬时表达的话是可以同时表达两个蛋白的。稳定表达的话需要看这两个基因是不是同时整合到宿主基因组里了。需要筛选。
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6楼2012-02-17 14:25:37
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susanuse

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 小周 at 2012-02-17 14:25:37:
没有用过这个细胞，我接触的都是CHO，293细胞。瞬时表达的话是可以同时表达两个蛋白的。稳定表达的话需要看这两个基因是不是同时整合到宿主基因组里了。需要筛选。

恩，是啊。我就是怕稳定转染的时候如果分别用自己的启动子和终止子，有可能不是所有的细胞都能把两个基因都整合了。
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7楼2012-02-17 15:48:57
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ixido

木虫 (小有名气)
amisking(金币+5): 鼓励积极应助！ 2012-02-17 18:28:57
1 除了楼上的方法外，楼主可以找一下pEGFP的载体，这个载体自身带有EGFP序列，并且可以在EGFPN端或者C端插入目的蛋白
2 这个问题不大明白，不知道楼主想要什么样的结果
3 筛选稳定细胞系，这个取决于你真核细胞表达载体上带有什么样的筛选基因。只要将质粒转染进细胞，然后按照筛选的条件和抗生素类型进行筛选就行了。但是周期很长，而且不一定能筛选出来。
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susanuse
8楼2012-02-17 16:10:58
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c3024034

银虫 (正式写手)
一般不会。这个也很难说，必须经过实践去检验。呵呵，一般我们为了追踪蛋白的去向会构建一个GFP和该蛋白的融合体，要不就需要放射性同位素标记了。
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10楼2012-02-18 14:13:08
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