应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细胞稳定转染，质粒的设计
71/1返回列表
查看: 3188  |  回复: 15
查看全部回帖 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

susanuse

银虫 (小有名气)

[求助] 细胞稳定转染，质粒的设计

小女子最近刚接触质粒。想请问，以下问题：
1，我想让我的目的蛋白在细胞中表达的同时，同时表达GFP，在不表达目的蛋白时，不表达GFP，这样的质粒怎么设计？怎么选取质粒？或者用别的载体？？
2，目的蛋白在细胞中的总表达量不受改变。就是说在以后的刺激试验中，该增加蛋白表达的时候增加，该减小的时候减小，不受转染影响。
3，我希望能稳定转染，建立永久的细胞系。

有没有哪位大侠能帮我解答一下。没坐过分子克隆方面的试验，一窍不通。谢谢指导
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-02-17 10:49:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susanuse

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by c3024034 at 2012-02-17 11:01:19:
把GFP与你的蛋白形成融合蛋白，构建质粒的时候把两个基因连一起，前一个去掉终止密码子。

请问大侠，那么把目的基因-GFP基因转入细胞以后会不会影响改蛋白在细胞中总的表达量？质粒又该怎么选呢？
赞一下 回复此楼
4楼2012-02-17 11:26:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susanuse

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 小周 at 2012-02-17 11:16:56:
楼上说的融合蛋白是一种方法。另外可以将两个基因（GFP和目的基因）在一个质粒中构建，分别用自己的启动子和终止子。

目的蛋白的表达量不受改变，要建立稳定的细胞株，大概耗时3-6个月的时间。还有你用的什么细 ...

大侠，请问如果质粒中分别用自己的启动子和终止子，能保证表达目的蛋白的时候就一定能表达GFP么？
我想用NMuMG细胞。
赞一下 回复此楼
5楼2012-02-17 11:28:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susanuse

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 小周 at 2012-02-17 14:25:37:
没有用过这个细胞，我接触的都是CHO，293细胞。瞬时表达的话是可以同时表达两个蛋白的。稳定表达的话需要看这两个基因是不是同时整合到宿主基因组里了。需要筛选。

恩，是啊。我就是怕稳定转染的时候如果分别用自己的启动子和终止子，有可能不是所有的细胞都能把两个基因都整合了。
赞一下 回复此楼
7楼2012-02-17 15:48:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susanuse

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by ixido at 2012-02-17 16:10:58:
1 除了楼上的方法外，楼主可以找一下pEGFP的载体，这个载体自身带有EGFP序列，并且可以在EGFPN端或者C端插入目的蛋白
2 这个问题不大明白，不知道楼主想要什么样的结果
3 筛选稳定细胞系，这个取决于你真核细胞 ...

非常感谢你的帮助。
我的目的是想让我的蛋白表达的时候能带有GFP，蛋白量的多少倒是无所谓。因为我的蛋白不是一开始就表达的，要刺激之后有表达。我只是希望看到有表达就行了，就是有或无的一个定性指标。
赞一下 回复此楼
11楼2012-02-20 10:17:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susanuse

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by lder at 2012-02-18 08:46:01:
第一个问题：构建共表达载体，将GFP基因与目标蛋白基因连接到同一个载体中，置于同一个启动子下。从理论上将这样可以保证两个基因的协同表达，通过检测GFP的表达量来预测目标蛋白的表达量。但是从实际经验上讲，即 ...

非常感谢你的帮助，很详细，让我了解了不少。
我就希望我的蛋白表达的同时又GFP，如果GFP与我目的蛋白表达量不一致也没关系，我只希望有或者无定性就可以。
我想进一步问一下。关于稳定转染或者瞬时转染这个技术。我目前是小白水平，见谅哈~~~
是不是当我想增强某个基因表达，一般都是瞬时转染，转一个基因，然后看结果。而稳定转染，只能让细胞里没有的基因，转入，而后稳定表达，而不能让已有的基因增强表达？
赞一下 回复此楼
12楼2012-02-20 10:22:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 susanuse 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭