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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细胞稳定转染，质粒的设计
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susanuse

银虫 (小有名气)

[求助] 细胞稳定转染，质粒的设计

小女子最近刚接触质粒。想请问，以下问题：
1，我想让我的目的蛋白在细胞中表达的同时，同时表达GFP，在不表达目的蛋白时，不表达GFP，这样的质粒怎么设计？怎么选取质粒？或者用别的载体？？
2，目的蛋白在细胞中的总表达量不受改变。就是说在以后的刺激试验中，该增加蛋白表达的时候增加，该减小的时候减小，不受转染影响。
3，我希望能稳定转染，建立永久的细胞系。

有没有哪位大侠能帮我解答一下。没坐过分子克隆方面的试验，一窍不通。谢谢指导
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1楼 2012-02-17 10:49:05
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susanuse

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by ixido at 2012-02-17 16:10:58:
1 除了楼上的方法外，楼主可以找一下pEGFP的载体，这个载体自身带有EGFP序列，并且可以在EGFPN端或者C端插入目的蛋白
2 这个问题不大明白，不知道楼主想要什么样的结果
3 筛选稳定细胞系，这个取决于你真核细胞 ...

非常感谢你的帮助。
我的目的是想让我的蛋白表达的时候能带有GFP，蛋白量的多少倒是无所谓。因为我的蛋白不是一开始就表达的，要刺激之后有表达。我只是希望看到有表达就行了，就是有或无的一个定性指标。
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11楼2012-02-20 10:17:48
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c3024034

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
susanuse(金币+5): ★★★很有帮助 2012-02-17 12:54:33
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-18 08:08:26
把GFP与你的蛋白形成融合蛋白，构建质粒的时候把两个基因连一起，前一个去掉终止密码子。
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2楼2012-02-17 11:01:19
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
susanuse(金币+5): ★★★很有帮助 2012-02-17 12:54:40
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-17 13:43:42
楼上说的融合蛋白是一种方法。另外可以将两个基因（GFP和目的基因）在一个质粒中构建，分别用自己的启动子和终止子。

目的蛋白的表达量不受改变，要建立稳定的细胞株，大概耗时3-6个月的时间。还有你用的什么细胞有关。
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3楼2012-02-17 11:16:56
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susanuse

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by c3024034 at 2012-02-17 11:01:19:
把GFP与你的蛋白形成融合蛋白，构建质粒的时候把两个基因连一起，前一个去掉终止密码子。

请问大侠，那么把目的基因-GFP基因转入细胞以后会不会影响改蛋白在细胞中总的表达量？质粒又该怎么选呢？
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4楼2012-02-17 11:26:30
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