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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细胞稳定转染，质粒的设计
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susanuse

银虫 (小有名气)

[求助] 细胞稳定转染，质粒的设计

小女子最近刚接触质粒。想请问，以下问题：
1，我想让我的目的蛋白在细胞中表达的同时，同时表达GFP，在不表达目的蛋白时，不表达GFP，这样的质粒怎么设计？怎么选取质粒？或者用别的载体？？
2，目的蛋白在细胞中的总表达量不受改变。就是说在以后的刺激试验中，该增加蛋白表达的时候增加，该减小的时候减小，不受转染影响。
3，我希望能稳定转染，建立永久的细胞系。

有没有哪位大侠能帮我解答一下。没坐过分子克隆方面的试验，一窍不通。谢谢指导
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1楼 2012-02-17 10:49:05
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susanuse

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by lder at 2012-02-18 08:46:01:
第一个问题：构建共表达载体，将GFP基因与目标蛋白基因连接到同一个载体中，置于同一个启动子下。从理论上将这样可以保证两个基因的协同表达，通过检测GFP的表达量来预测目标蛋白的表达量。但是从实际经验上讲，即 ...

非常感谢你的帮助，很详细，让我了解了不少。
我就希望我的蛋白表达的同时又GFP，如果GFP与我目的蛋白表达量不一致也没关系，我只希望有或者无定性就可以。
我想进一步问一下。关于稳定转染或者瞬时转染这个技术。我目前是小白水平，见谅哈~~~
是不是当我想增强某个基因表达，一般都是瞬时转染，转一个基因，然后看结果。而稳定转染，只能让细胞里没有的基因，转入，而后稳定表达，而不能让已有的基因增强表达？
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12楼2012-02-20 10:22:06
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c3024034

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
susanuse(金币+5): ★★★很有帮助 2012-02-17 12:54:33
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-18 08:08:26
把GFP与你的蛋白形成融合蛋白，构建质粒的时候把两个基因连一起，前一个去掉终止密码子。
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2楼2012-02-17 11:01:19
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
susanuse(金币+5): ★★★很有帮助 2012-02-17 12:54:40
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-17 13:43:42
楼上说的融合蛋白是一种方法。另外可以将两个基因（GFP和目的基因）在一个质粒中构建，分别用自己的启动子和终止子。

目的蛋白的表达量不受改变，要建立稳定的细胞株，大概耗时3-6个月的时间。还有你用的什么细胞有关。
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3楼2012-02-17 11:16:56
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susanuse

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by c3024034 at 2012-02-17 11:01:19:
把GFP与你的蛋白形成融合蛋白，构建质粒的时候把两个基因连一起，前一个去掉终止密码子。

请问大侠，那么把目的基因-GFP基因转入细胞以后会不会影响改蛋白在细胞中总的表达量？质粒又该怎么选呢？
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4楼2012-02-17 11:26:30
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