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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】G418筛选稳定转染
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chen860729

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】G418筛选稳定转染 已有5人参与

转染pEGFP-N1载体，然后用G418筛选，筛选很长时间，细胞没有死亡，但是没有表达绿色荧光。pEGFP-N1载体能整合到真核细胞的染色体上吗？
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1楼 2010-10-04 14:40:21
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)
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不一定的，看你的同源的效果了
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2楼2010-10-04 16:16:30
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
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reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-10-06 08:35:16
在筛选剂条件下细胞有逃逸的可能，先设一个筛选浓度的梯度，看看对照组细胞在什么浓度下完全不生长，就用那个浓度筛选
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3楼2010-10-04 17:58:53
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我本兽医

铁虫 (初入文坛)
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我也做稳定筛选方面的实验，也遇到了您所说的问题，已经持续快一年了，始终不行。建议你不要完全信任真核表达载体，最好还是要尝试一下病毒载体。
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4楼2010-10-04 22:54:13
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chen860729

新虫 (初入文坛)
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Originally posted by 虫子火箭兵 at 2010-10-04 17:58:53:
在筛选剂条件下细胞有逃逸的可能，先设一个筛选浓度的梯度，看看对照组细胞在什么浓度下完全不生长，就用那个浓度筛选

我们用的浓度是对照组的细胞在六天到七天全部死亡，这个浓度可以吗？
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5楼2010-10-05 15:15:59
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chen860729

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lwiaanngg at 2010-10-04 16:16:30:
不一定的，看你的同源的效果了

用的是脂质体转染的，能整合到染色体上吗？
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6楼2010-10-05 15:18:07
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)
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reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-10-06 08:35:37
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Originally posted by chen860729 at 2010-10-05 15:18:07:

用的是脂质体转染的，能整合到染色体上吗？

方法自然是正确的，也是很多人做过的。但不代表一定对你的case能够合适。
LZ检查一下整个实验过程，可能在哪个地方出现了纰漏
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7楼2010-10-06 08:24:12
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chen860729

新虫 (初入文坛)
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Originally posted by 我本兽医 at 2010-10-04 22:54:13:
我也做稳定筛选方面的实验，也遇到了您所说的问题，已经持续快一年了，始终不行。建议你不要完全信任真核表达载体，最好还是要尝试一下病毒载体。

请问你知道这是什么原因吗？我们筛选的细胞都十几天了，没有死，但是也观察不到荧光
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8楼2010-10-06 21:28:48
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我本兽医

铁虫 (初入文坛)
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Originally posted by chen860729 at 2010-10-06 21:28:48:

请问你知道这是什么原因吗？我们筛选的细胞都十几天了，没有死，但是也观察不到荧光

我尝试过用真核表达载体做稳定表达，两次。每次刚加药筛选时，都有大量细胞死亡，少量细胞存活，到最后加大药物浓度，细胞也不死了，就拿去用荧光检查，发现没有任何阳性的荧光信号。跟一位博士师兄谈过这个问题，他给出的方法是：1，把构建好的环状质粒，进行酶切，使其线性化。2，重新将目的基因连接到一个病毒载体上（比如腺病毒或者逆转录病毒），因为病毒载体上都会有一种基因，能让病毒的基因组插入到宿主细胞的基因组中（这也是病毒复制的一步）并整合在一起，以此达到我们做稳定表达的目的。
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9楼2010-10-07 08:50:46
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匿名

用户注销 (著名写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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10楼2015-05-16 15:04:52
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