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chen860729

新虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】G418筛选稳定转染已有5人参与

转染pEGFP-N1载体，然后用G418筛选，筛选很长时间，细胞没有死亡，但是没有表达绿色荧光。pEGFP-N1载体能整合到真核细胞的染色体上吗？

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1楼2010-10-04 14:40:21

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我本兽医

铁虫 (初入文坛)

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引用回帖:

Originally posted by chen860729 at 2010-10-06 21:28:48:

请问你知道这是什么原因吗？我们筛选的细胞都十几天了，没有死，但是也观察不到荧光

我尝试过用真核表达载体做稳定表达，两次。每次刚加药筛选时，都有大量细胞死亡，少量细胞存活，到最后加大药物浓度，细胞也不死了，就拿去用荧光检查，发现没有任何阳性的荧光信号。跟一位博士师兄谈过这个问题，他给出的方法是：1，把构建好的环状质粒，进行酶切，使其线性化。2，重新将目的基因连接到一个病毒载体上（比如腺病毒或者逆转录病毒），因为病毒载体上都会有一种基因，能让病毒的基因组插入到宿主细胞的基因组中（这也是病毒复制的一步）并整合在一起，以此达到我们做稳定表达的目的。