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chen860729

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】G418筛选稳定转染已有5人参与

转染pEGFP-N1载体,然后用G418筛选,筛选很长时间,细胞没有死亡,但是没有表达绿色荧光。pEGFP-N1载体能整合到真核细胞的染色体上吗?
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我本兽医

铁虫 (初入文坛)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-10-06 08:35:26
我也做稳定筛选方面的实验,也遇到了您所说的问题,已经持续快一年了,始终不行。建议你不要完全信任真核表达载体,最好还是要尝试一下病毒载体。
4楼2010-10-04 22:54:13
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我本兽医

铁虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by chen860729 at 2010-10-06 21:28:48:

请问你知道这是什么原因吗?我们筛选的细胞都十几天了,没有死,但是也观察不到荧光

我尝试过用真核表达载体做稳定表达,两次。每次刚加药筛选时,都有大量细胞死亡,少量细胞存活,到最后加大药物浓度,细胞也不死了,就拿去用荧光检查,发现没有任何阳性的荧光信号。跟一位博士师兄谈过这个问题,他给出的方法是:1,把构建好的环状质粒,进行酶切,使其线性化。2,重新将目的基因连接到一个病毒载体上(比如腺病毒或者逆转录病毒),因为病毒载体上都会有一种基因,能让病毒的基因组插入到宿主细胞的基因组中(这也是病毒复制的一步)并整合在一起,以此达到我们做稳定表达的目的。
9楼2010-10-07 08:50:46
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