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susanuse

银虫 (小有名气)

[求助] 细胞稳定转染,质粒的设计

小女子最近刚接触质粒。想请问,以下问题:
1,我想让我的目的蛋白在细胞中表达的同时,同时表达GFP,在不表达目的蛋白时,不表达GFP,这样的质粒怎么设计?怎么选取质粒?或者用别的载体??
2,目的蛋白在细胞中的总表达量不受改变。就是说在以后的刺激试验中,该增加蛋白表达的时候增加,该减小的时候减小,不受转染影响。
3,我希望能稳定转染,建立永久的细胞系。

有没有哪位大侠能帮我解答一下。没坐过分子克隆方面的试验,一窍不通。谢谢指导
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by susanuse at 2012-02-17 11:28:34:
大侠,请问如果质粒中分别用自己的启动子和终止子,能保证表达目的蛋白的时候就一定能表达GFP么?
我想用NMuMG细胞。

没有用过这个细胞,我接触的都是CHO,293细胞。瞬时表达的话是可以同时表达两个蛋白的。稳定表达的话需要看这两个基因是不是同时整合到宿主基因组里了。需要筛选。
6楼2012-02-17 14:25:37
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c3024034

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
susanuse(金币+5): ★★★很有帮助 2012-02-17 12:54:33
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-18 08:08:26
把GFP与你的蛋白形成融合蛋白,构建质粒的时候把两个基因连一起,前一个去掉终止密码子。
2楼2012-02-17 11:01:19
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
susanuse(金币+5): ★★★很有帮助 2012-02-17 12:54:40
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-17 13:43:42
楼上说的融合蛋白是一种方法。另外可以将两个基因(GFP和目的基因)在一个质粒中构建,分别用自己的启动子和终止子。

目的蛋白的表达量不受改变,要建立稳定的细胞株,大概耗时3-6个月的时间。还有你用的什么细胞有关。
3楼2012-02-17 11:16:56
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susanuse

银虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by c3024034 at 2012-02-17 11:01:19:
把GFP与你的蛋白形成融合蛋白,构建质粒的时候把两个基因连一起,前一个去掉终止密码子。

请问大侠,那么把目的基因-GFP基因转入细胞以后会不会影响改蛋白在细胞中总的表达量?质粒又该怎么选呢?
4楼2012-02-17 11:26:30
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