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细胞稳定转染，质粒的设计
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小女子最近刚接触质粒。想请问，以下问题： 1，我想让我的目的蛋白在细胞中表达的同时，同时表达GFP，在不表达目的蛋白时，不表达GFP，这样的质粒怎么设计？怎么选取质粒？或者用别的载体？？ 2，目的蛋白在细胞中的总表达量不受改变。就是说在以后的刺激试验中，该增加蛋白表达的时候增加，该减小的时候减小，不受转染影响。 3，我希望能稳定转染，建立永久的细胞系。 有没有哪位大侠能帮我解答一下。没坐过分子克隆方面的试验，一窍不通。谢谢指导 |
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lder 
木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
小丹木木(金币+5, MolEPI+1): 很热心哦 2012-02-20 10:21:06
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第一个问题：构建共表达载体，将GFP基因与目标蛋白基因连接到同一个载体中，置于同一个启动子下。从理论上将这样可以保证两个基因的协同表达，通过检测GFP的表达量来预测目标蛋白的表达量。但是从实际经验上讲，即使在同一个启动子，也不能保证GFP与目标蛋白的表达量一致，通常而这的表达量会相差10倍甚至更多，这直接与基因的序列，表达效率有关。 第二个问题：你说的问题的实质是转化体基因组中目的基因的拷贝数稳定。拷贝数的多少及目的基因插入的位点决定了细胞中目的蛋白的表达量。只要目的基因插入的位点及拷贝数稳定了，你所说的问题也就解决了。而拷贝数及插入位点的稳定化，其实就是要建立稳定细胞系，因为稳定细胞系之所以稳定就是因为其目的基因的拷贝数及插入位点稳定。 第三个问题：建立稳定细胞系，就是要挑单克隆细胞了。使用电转化和脂质体转化可以提高稳定转化的效率，这两种方法的稳定转染效率最高，可以达到60-80%。转染之后的挑选单克隆可以使用有限稀释法和流式细胞仪分选法以及clonePIX FL 来做。有限稀释费事费力，基本是靠人力来做了，后两种方法有快多了，但是仪器昂贵多了。 |
9楼2012-02-18 08:46:01
2楼2012-02-17 11:01:19
小周
铁杆木虫 (著名写手)
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3楼2012-02-17 11:16:56
4楼2012-02-17 11:26:30
