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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒DNA转染遇到的一些问题
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_wuliao_

木虫 (正式写手)

[求助] 质粒DNA转染遇到的一些问题 已有5人参与

本人是学化学专业的，现在交叉做点生物上的细胞转染实验，我用的是纳米材料转染PEGFP-C1质粒，用的是CHO细胞。我发现，每次用荧光显微镜看荧光的时候都能看到模模糊糊的，没办法聚焦的荧光，而且这个荧光也明显没有用lipsome 2000转染的量多，不知道这个荧光到底是哪来的？我的材料是没有荧光的，而且我用lipsome 2000转染过，荧光是非常强的，不知道我的实验遇到了什么问题。
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1楼 2014-07-25 14:00:45
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★
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_wuliao_(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-07-25 20:16:10
不是很明白你问的问题，你的材料是没有 荧光，但你转染的治理pEGFP-C1是表达GFP的，在荧光显微镜下能看到绿色的荧光
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2014-07-25 14:08:13
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_wuliao_

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2014-07-25 14:08:13
不是很明白你问的问题，你的材料是没有 荧光，但你转染的治理pEGFP-C1是表达GFP的，在荧光显微镜下能看到绿色的荧光

我用纳米材料转染的目的就是想看下纳米材料到底能不能作为转染试剂。我困惑的地方就是我用lipsome 2000转染得到的荧光跟我用纳米材料转染得到的荧光是不一样的，lipsome 2000得到的荧光很强，而且很清晰。但是我用纳米材料得到的荧光很弱。我不知道用纳米材料得到的荧光是不是GFP的荧光。如果不是的话，那这个弱弱的荧光有可能是什么东西呢
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3楼2014-07-25 15:42:22
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-25 22:01:50
_wuliao_: 金币+8, ★★★很有帮助 2014-07-28 09:22:32
引用回帖:
3楼: Originally posted by _wuliao_ at 2014-07-25 15:42:22
我用纳米材料转染的目的就是想看下纳米材料到底能不能作为转染试剂。我困惑的地方就是我用lipsome 2000转染得到的荧光跟我用纳米材料转染得到的荧光是不一样的，lipsome 2000得到的荧光很强，而且很清晰。但是我用 ...

“荧光不一样”是怎么不一样？强度不一样？波段不一样？

GFP是绿色荧光，excitation/emission的波段是488nm/509nm。我不是太明白你观察的方式，如果用同样的滤镜可以看到的话，应该就是同一荧光了。荧光强度跟转染量/表达量有很大关系。有可能你的纳米材料转染效率本身就没有lipsome 2000那么高。

你可以转染之后用流式测定一下转染率。并且做一下对照组，同时用纳米材料转染别的质粒，最好是带有外源标记基因但是非荧光的。比如表达人类表面抗原之类。以确认你的转染不会产生自身荧光。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
4楼2014-07-25 20:48:33
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maleyin

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
_wuliao_: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-07-28 09:22:23
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-28 19:26:12
如果所有的实验条件都一样，只有转染试剂不一样，那应该是你合成的纳米材料的转染效率不如脂质体2000吧.
不过细胞对转染效率也有影响，你的纳米材料对CHO的转染效率可能不如脂质体2000，但是对其它细胞，可能你的纳米材料的转染效率又有可能比脂质体2000.楼主不妨一试
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温柔要有，霸气也要有。
5楼2014-07-26 09:54:13
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_wuliao_

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-25 20:48:33
“荧光不一样”是怎么不一样？强度不一样？波段不一样？

GFP是绿色荧光，excitation/emission的波段是488nm/509nm。我不是太明白你观察的方式，如果用同样的滤镜可以看到的话，应该就是同一荧光了。荧光强度跟转 ...

我观察的时候用的是同样的滤镜。我的材料的转染效率应该是没有lipsome 2000那么高的，我用lipsome 2000转染生成GFP荧光是很强的，但是用纳米材料转染后的荧光很弱，我就是在疑惑我用纳米材料转染后看到的荧光会不会就不是GFP所产生的呢
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6楼2014-07-28 09:29:18
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-21 16:02:10
引用回帖:
6楼: Originally posted by _wuliao_ at 2014-07-28 09:29:18
我观察的时候用的是同样的滤镜。我的材料的转染效率应该是没有lipsome 2000那么高的，我用lipsome 2000转染生成GFP荧光是很强的，但是用纳米材料转染后的荧光很弱，我就是在疑惑我用纳米材料转染后看到的荧光会不会 ...

应该是由GFP产生的，如果无法排除细胞培养所产生的自身荧光的话，就暗我说的那样加上对照组吧。同样方法用含有非荧光标记基因的质粒转染细胞，观察有没有自身荧光。

如果能用流式的话，就更加容易对比转染效率，你可以直接得出转染成功细胞的百分比。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
7楼2014-07-28 19:00:00
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
_wuliao_(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-06 22:53:48
可能是背景荧光，你用个没有任何处理的细胞比较一下。
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8楼2014-07-29 11:24:42
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123小莜

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by _wuliao_ at 2014-07-25 15:42:22
我用纳米材料转染的目的就是想看下纳米材料到底能不能作为转染试剂。我困惑的地方就是我用lipsome 2000转染得到的荧光跟我用纳米材料转染得到的荧光是不一样的，lipsome 2000得到的荧光很强，而且很清晰。但是我用 ...

你好 我想问一下你做的转染直接用pEGFP-C1这个质粒转染吗 需要加目的基因吗
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9楼2014-09-06 21:32:39
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langzian

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

控制变量，你现在有的条件：培养环境及细胞，lipsome, 质粒，纳米材料。实验有：lipsome 转和纳米转，再加一个不加转染试剂的对照吧，很有可能是培养板的荧光素

[ 发自小木虫客户端 ]
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江山
10楼2014-09-09 14:29:47
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