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wsmcc

金虫 (小有名气)

[交流] 细胞瞬时转染和质粒复制

大家好！
我有个问题
最近在做细胞转染，用的是293细胞和pcDNA3.1质粒。
我想问的是，质粒会在细胞中复制么？

如果质粒在细胞中复制，为什么又要筛选做稳定株？
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1楼 2013-03-13 10:42:56
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回帖置顶 ( 共有1个 )

gyesang

荣誉版主 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
wsmcc(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 热心的斑斑 2013-03-13 16:31:57
引用回帖:
5楼: Originally posted by wsmcc at 2013-03-13 13:29:28
可是，我看到论坛里有人说，有SV40和T抗原就可以，可是如果有的话，又为何要做稳定株筛选？穿梭质粒的定义里面，有可以复制这一说呀...

293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad 5) DNA的永生化细胞，表达转染的腺病毒5的基因。

293T细胞表达 E1A蛋白和SV40大T抗原，因此含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以在其中复制。

你最近在做细胞转染，用的是293细胞和pcDNA3.1质粒，因为293细胞不含有SV40大T抗原，因此即使pcDNA3.1质粒含有SV40 ori，pcDNA3.1也不能在293细胞中复制，如果你转染的是293T细胞，那么pcDNA3.1 就可在其中复制了。

至于为什么又要筛选做稳定株，是因为质粒转染进293细胞作为episome的形式存在，不能复制，随着细胞的分裂，质粒会被随机分配到其两子代细胞中发生稀释至最终丢失。而筛选出来的稳定株，此时的质粒已经被整合进宿主染色体，随着宿主基因组DNA的复制而一起复制，并稳定遗传给子代。
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9楼2013-03-13 15:00:13
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userhung

禁虫 (文学泰斗)
★
wsmcc(金币+1): 谢谢参与
http://www.dxy.cn/bbs/topic/11879975
http://www.dxy.cn/bbs/topic/11626894
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3楼2013-03-13 11:25:54
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普通回帖

lidonghong

金虫 (正式写手)
★
wsmcc(金币+1): 谢谢参与
这个嘛，说说我的理解，一开始转染进去时可以复制的，但是随着培养的时间的延长，细胞发现这个质粒不是本身的东西所以就清除掉了。。。。
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2楼2013-03-13 11:22:42
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wsmcc

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by userhung at 2013-03-13 11:25:54
http://www.dxy.cn/bbs/topic/11879975
http://www.dxy.cn/bbs/topic/11626894

我看了您的链接，貌似没有相关性……
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4楼2013-03-13 13:28:02
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wsmcc

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lidonghong at 2013-03-13 11:22:42
这个嘛，说说我的理解，一开始转染进去时可以复制的，但是随着培养的时间的延长，细胞发现这个质粒不是本身的东西所以就清除掉了。。。。

可是，我看到论坛里有人说，有SV40和T抗原就可以，可是如果有的话，又为何要做稳定株筛选？穿梭质粒的定义里面，有可以复制这一说呀
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5楼2013-03-13 13:29:28
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448935271

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
wsmcc(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-03-13 16:31:14
我之前就是用293E细胞做瞬时转染的，之所以要筛选稳定株是因为，那些瞬转的细胞在培养几代之后，质粒就会出现丢失状况，而没有转入质粒的细胞的生命力会更强一些，久而久之那些没有把质粒丢失的细胞就会被淹没了
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6楼2013-03-13 14:35:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
wsmcc(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
5楼: Originally posted by wsmcc at 2013-03-13 13:29:28
可是，我看到论坛里有人说，有SV40和T抗原就可以，可是如果有的话，又为何要做稳定株筛选？穿梭质粒的定义里面，有可以复制这一说呀...

我觉得是这样。质粒的复制和染色体不同步，拷贝数不是很稳定。因此，在穿梭质粒表达的话可能随着细胞生长状态、时期而变化，所以需要做稳定株。
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7楼2013-03-13 14:38:30
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lidonghong

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wsmcc at 2013-03-13 13:29:28
可是，我看到论坛里有人说，有SV40和T抗原就可以，可是如果有的话，又为何要做稳定株筛选？穿梭质粒的定义里面，有可以复制这一说呀...

这个问题就不太清楚了，可能需要差点参考文献才行
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8楼2013-03-13 14:41:49
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huoyongting

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
wsmcc(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-04-26 21:23:57
除了SV40和T抗原的组合，还有293E细胞和带有EBNV病毒复制原点（oriP）的质粒也可以，比如PTT5载体，这个也可以在293E里扩增的
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11楼2013-03-14 17:22:56
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26264716

铁虫 (小有名气)
★
wsmcc(金币+1): 谢谢参与
在293细胞里，不会复制，只有在293T里能复制。。。
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12楼2013-03-15 13:00:57
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
★
wsmcc(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
6楼: Originally posted by 448935271 at 2013-03-13 14:35:19
我之前就是用293E细胞做瞬时转染的，之所以要筛选稳定株是因为，那些瞬转的细胞在培养几代之后，质粒就会出现丢失状况，而没有转入质粒的细胞的生命力会更强一些，久而久之那些没有把质粒丢失的细胞就会被淹没了

你好，我想请问下，你们筛选到稳定表达的细胞株了么？会不会出现后期丢失的现象？
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14楼2013-03-31 21:47:09
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448935271

银虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by sarah-miao at 2013-03-31 21:47:09
你好，我想请问下，你们筛选到稳定表达的细胞株了么？会不会出现后期丢失的现象？...

在筛选出前我就已经辞职了，不过如果筛选出应该就不会出现丢失现象了
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15楼2013-04-01 15:18:45
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myprayer

专家顾问 (著名写手)
★
wsmcc(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
10楼: Originally posted by yingying1588 at 2013-03-13 19:55:13

请勿单纯的回复表情之类的，希望小虫子予以理解支持。
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16楼2013-04-01 21:26:04
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
15楼: Originally posted by 448935271 at 2013-04-01 15:18:45
在筛选出前我就已经辞职了，不过如果筛选出应该就不会出现丢失现象了...

额，我在虫子上看到很多丢失的，之前筛到阳性传到10代还是没了，还指望这个研究生毕业呢，哎
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17楼2013-04-02 16:04:29
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448935271

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-07 00:57:49
引用回帖:
17楼: Originally posted by sarah-miao at 2013-04-02 16:04:29
额，我在虫子上看到很多丢失的，之前筛到阳性传到10代还是没了，还指望这个研究生毕业呢，哎...

稳定表达株就是把目的片段已经整合到染色体上了，怎么可能传10代就丢失呢，这也太不靠谱了
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18楼2013-04-02 16:43:41
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
18楼: Originally posted by 448935271 at 2013-04-02 16:43:41
稳定表达株就是把目的片段已经整合到染色体上了，怎么可能传10代就丢失呢，这也太不靠谱了...

我觉得可能我筛到的本来就不是阳性，会不会有细胞产生耐抗性的说法呢？
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19楼2013-04-02 22:29:57
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
求问一下大家用的质粒都是用转染级别试剂盒提取的么?有没有便宜点的方法呀
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20楼2013-05-06 23:23:47
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尚艳楠

铁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 448935271 at 2013-03-13 14:35:19
我之前就是用293E细胞做瞬时转染的，之所以要筛选稳定株是因为，那些瞬转的细胞在培养几代之后，质粒就会出现丢失状况，而没有转入质粒的细胞的生命力会更强一些，久而久之那些没有把质粒丢失的细胞就会被淹没了

请问那怎么建立稳定的细胞株呀？   谢谢
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21楼2014-10-28 20:39:48
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尚艳楠

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by sarah-miao at 2013-04-02 16:04:29
额，我在虫子上看到很多丢失的，之前筛到阳性传到10代还是没了，还指望这个研究生毕业呢，哎...

哦，我也是呀，那请问你最后怎么办了？
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22楼2014-10-28 20:41:29
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
22楼: Originally posted by 尚艳楠 at 2014-10-28 20:41:29
哦，我也是呀，那请问你最后怎么办了？...

换的一个课题毕业的
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23楼2014-10-29 08:50:13
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古月问你哦

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
其实这个问题归根结底就是：瞬时转染和稳定转染的区别，瞬时转染的目的是得到少量的一些蛋白实验一下，如果蛋白可用而且需要大量生产的话，就要进行稳定转染筛选稳定细胞株，只要筛选稳定细胞株，直接培养这个细胞株就可以方便容易的得到大量的蛋白，因为瞬转不能满足大量生产的需求，培养1L细胞需要1mg质粒只能得到1mg蛋白，如果需要1g 2g甚至更大量的蛋白，那要多少质粒才能满足需求，那样光合成质粒就要花几百万，所以只能筛选稳定细胞株才能解决这个问题，如果知道瞬转和稳转的原理也就明白这个意思了，瞬时转染表达质粒基因组不整合到细胞自身基因组上随着细胞的生长分裂3-4天质粒基因就会丢失，这时候收集细胞，只能得到很少量的质粒表达的蛋白，而稳定转染是吧外源基因直接整合到细胞基因组上，经过一系列的抗性筛选最终得到能够稳定表达的细胞株，这就是稳定转染
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24楼2015-10-29 15:00:54
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简单回复
yingying158810楼
2013-03-13 19:55  
wsmcc(金币+1): 谢谢参与
haixiawu13楼
2013-03-19 05:53  
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