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细胞瞬时转染和质粒复制
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大家好！ 我有个问题 最近在做细胞转染，用的是293细胞和pcDNA3.1质粒。 我想问的是，质粒会在细胞中复制么？ 如果质粒在细胞中复制，为什么又要筛选做稳定株？ |
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 分子生化实验经验积累 | 【分子生物】EPI帖 |
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gyesang
荣誉版主 (著名写手)
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wsmcc(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 热心的斑斑 2013-03-13 16:31:57
wsmcc(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 热心的斑斑 2013-03-13 16:31:57
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293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad 5) DNA的永生化细胞，表达转染的腺病毒5的基因。 293T细胞表达 E1A蛋白和SV40大T抗原，因此含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以在其中复制。 你最近在做细胞转染，用的是293细胞和pcDNA3.1质粒，因为293细胞不含有SV40大T抗原，因此即使pcDNA3.1质粒含有SV40 ori，pcDNA3.1也不能在293细胞中复制，如果你转染的是293T细胞，那么pcDNA3.1 就可在其中复制了。 至于为什么又要筛选做稳定株，是因为质粒转染进293细胞作为episome的形式存在，不能复制，随着细胞的分裂，质粒会被随机分配到其两子代细胞中发生稀释至最终丢失。而筛选出来的稳定株，此时的质粒已经被整合进宿主染色体，随着宿主基因组DNA的复制而一起复制，并稳定遗传给子代。 |
9楼2013-03-13 15:00:13
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wsmcc(金币+1): 谢谢参与
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3楼2013-03-13 11:25:54
2楼2013-03-13 11:22:42
4楼2013-03-13 13:28:02
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17楼2013-04-02 16:04:29
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19楼2013-04-02 22:29:57
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21楼2014-10-28 20:39:48
22楼2014-10-28 20:41:29
23楼2014-10-29 08:50:13
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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| 其实这个问题归根结底就是：瞬时转染和稳定转染的区别，瞬时转染的目的是得到少量的一些蛋白实验一下，如果蛋白可用而且需要大量生产的话，就要进行稳定转染筛选稳定细胞株，只要筛选稳定细胞株，直接培养这个细胞株就可以方便容易的得到大量的蛋白，因为瞬转不能满足大量生产的需求，培养1L细胞需要1mg质粒只能得到1mg蛋白，如果需要1g 2g甚至更大量的蛋白，那要多少质粒才能满足需求，那样光合成质粒就要花几百万，所以只能筛选稳定细胞株才能解决这个问题，如果知道瞬转和稳转的原理也就明白这个意思了，瞬时转染表达质粒基因组不整合到细胞自身基因组上随着细胞的生长分裂3-4天质粒基因就会丢失，这时候收集细胞，只能得到很少量的质粒表达的蛋白，而稳定转染是吧外源基因直接整合到细胞基因组上，经过一系列的抗性筛选最终得到能够稳定表达的细胞株，这就是稳定转染 |
24楼2015-10-29 15:00:54
简单回复
yingying158810楼
2013-03-13 19:55
wsmcc(金币+1): 谢谢参与
haixiawu13楼
2013-03-19 05:53
