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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 如何实现质粒的稳定转染？
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flybirdfly

木虫 (正式写手)

奋斗者

[求助] 如何实现质粒的稳定转染？ 已有4人参与

小虫现需要将一仅带有氨苄西林霉素基因的质粒稳定转染293T细胞，不知使用何种方法。有文献中是这样做的：将该质粒与pCDNA3以4:1的比例共转染（因为pCDNA3中含有neomycin的基因），然后就可以用G418筛选出稳转的细胞株。另有人说建议用Linear Selection Marker，如Linear Puromycin Marker，使具有嘌呤霉素抗性，然后用抗性培养基多次筛选。我想问一下这两种方法哪个更靠谱一点？请各位虫友不吝赐教
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Your attitude, not your aptitude, will determine your altitude. 努力！奋斗！
1楼 2014-03-17 10:56:13
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
共转pCDNA 3.1是可以的，原则上pCDNA 3.1转染进了，你的目的基因也应该转染了，第二种没做过，但是也是用抗性筛选的吧
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2楼2014-03-17 12:21:14
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weskerZXC

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看看质粒的真核筛选基因，一般是neo抗性就用G418筛选
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3楼2014-03-18 10:25:43
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c_jade

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
都可以，以前实验室常用G418，效果不错。
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4楼2014-03-18 14:19:12
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simplelcc

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
给你的目的基因换一个稳定表达的载体吧。感觉pCDNA3.1做瞬时转染效果很好，但做稳定转染不是很稳定。个人更喜欢Puromycin作为抗性筛选。
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5楼2014-03-18 15:01:29
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星期天我放风
6楼2014-03-18 21:20:17
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hailey

银虫 (小有名气)
想问一下。。。筛选抗性所用G418 的浓度是多少？？
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时刻为梦想而战！！
7楼2014-07-13 15:20:34
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MarchZR

银虫 (小有名气)
带有neo基因可以进行稳转细胞系建立，然后利用MTX加压筛选不断一轮一轮的筛选最终也能够进行稳转株筛选，我们经常用第二种方式，时间持续较长得到的稳转株也能够实现稳定高表达的生产，可以根据你的情况或时间啊选择一种更合适的。楼上有的说做瞬时转染好，其实也是啊，如果你还没有做过瞬转的话可以先做瞬转看看你的目的基因表达出来的东西性能怎样是不是符合要求，因为瞬时转染生产少量的蛋白满足检测如果后续你需要大量的生产在考虑构建稳定细胞系，比较筛选稳转株需要长时间，要是已经做过瞬转就不需要考虑了
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8楼2015-11-05 10:39:12
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ZYJLL

新虫 (小有名气)
请问最后你怎么解决的呀，有没有用linear selection marker呀

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9楼2018-07-16 11:42:36
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