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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒稳定性的问题
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friya0910

新虫 (正式写手)

[交流] 质粒稳定性的问题 已有4人参与

目的片段转化连接后，挑单克隆摇菌，获得第一代菌，可是如果取第一代菌加入ＬＢ（含抗生素）再摇的话，连有目的片段的质粒会变吗？为什么我送的第一代菌液测序都挺正常的，可是第二代菌液测出来就好多不正常的呀？不是有碱基缺失就是根本找不到下游引物呢！从Ｔ载体上切目的片段，大家是不是都从第一代菌里提质粒切啊？还是可以一代一代的摇啊？
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1楼 2011-07-10 19:27:28
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
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1949stone(金币+1): 鼓励 鼓励 2011-07-10 20:37:08
不可能总是用第一代的呀，我们都是一代一代的摇的，没你说的问题。
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2楼2011-07-10 19:48:03
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★
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1949stone(金币+1): 学习一下 2011-07-10 20:37:20
我们也遇到过相同的问题，有些质粒只在第一代菌里面是正确的，接种之后摇出来的菌全是错误的，解决的方法是多转几种不同的感受态细胞，找出能在里面稳定克隆的菌株。
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3楼2011-07-10 19:50:05
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gwbk

木虫 (正式写手)
★ ★
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dhd997(金币+1): 有解决办法吗 2011-07-11 07:44:08
这个确实是一个问题，我也出现了这种问题，不过是在换载体后出现的，想起来挺郁闷的。
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4楼2011-07-10 21:48:28
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gwbk

木虫 (正式写手)
★
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1949stone(EPI+1): 很好啊 学习了 2011-07-11 10:27:20
可能跟实验操作有关系，也可能跟宿主有关系，我的实验跟我的实验操作有关系，因为同样的宿主，有一株测序完全正确的。
有几点建议
1，切胶回收，凝胶拍照的时候，尽量减少紫外照射时间。我的突变是点是NNNGTTNNN，GT缺失，测序结果是NNNTNNN，怀疑跟嘧啶二聚体的形成有关。
2，实验操作该轻柔的一定不要剧烈。提质粒加NaOH时候，要求是轻摇5-8次，按照说明操作就行。

点突变可能是化学试剂、物理因素如紫外线、宿主对质粒的兼容性造成的，做实验的时候多注意点，找出自己突变的原因才是最关键的。
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5楼2011-07-11 09:55:00
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足下客

木虫 (正式写手)
★
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重组质粒转入菌中，发生突变是非常常见的现象。目前，工业上用于大型发酵的菌株，大部分都是用第一代基因工程菌上罐，现在基因工程菌在很多行业都受到了限制，出于它的安全性考虑，非常不稳定 。
所以说要想避免质粒在后续的传代过程中不发生变化，是几乎不可能做到的。尽量不要向下传代太多次。一定要把原始的质粒保存好。
如果把质粒转到菌株中保存，在每次活化之后，最好是做验证，确认质粒没有发生变化。
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6楼2011-07-11 13:24:31
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 足下客 at 2011-07-11 13:24:31:
重组质粒转入菌中，发生突变是非常常见的现象。目前，工业上用于大型发酵的菌株，大部分都是用第一代基因工程菌上罐，现在基因工程菌在很多行业都受到了限制，出于它的安全性考虑，非常不稳定 。
所以说要想避免 ...

每次活化以后还要测序验证，那岂不是很麻烦呢！
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7楼2011-07-11 21:14:25
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gwbk

木虫 (正式写手)
★
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工业用菌一般保密性很强的，他们从来不送去测序哦~~
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8楼2011-07-11 21:45:51
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gwbk

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
工业用菌确实存在很多问题，免不了质粒丢失严重，高突变等现象，但是一般工业用菌都是经过10代以上稳定筛选之后才用于小试、中试和工业生产的。菌体不稳定造可能成的损失巨大，所以鲜有工业用菌使用在2-3代菌就没有产量或者产量低的菌株。一般来说，一代菌用一点少一点，一代菌上罐太伤了，工业用菌一般会存储足够量的二代菌（多数是冷冻干燥安瓿管）用于生产，在生产中需要活化、制作摇瓶种子，如果菌体生长慢，还要进一步做种子罐，最后才能用于生产。如果菌体稳定性差，几代传下来，发酵的不稳定造成损失是很难估计的，而且一般不稳定菌都是先做小试、中试，成功后才能用于生产。

质粒在宿主中的稳定性确实需要进行筛选，实验中遇到的质粒突变能避免尽量避免，做好的质粒也不一定一直存放，由于不断的被用于各种改进实验，期间经过的大量筛选，避免了一代菌用完之后就没有更好的使用。使用高保真酶扩增、保证没有物理化学因素促变，使用合适的宿主，还是很容易得到没有突变的质粒的，后续连续传代培养也可以得到比较稳定的质粒的。
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9楼2011-07-11 22:12:29
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