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friya0910新虫 (正式写手)
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[交流]
质粒稳定性的问题 已有4人参与
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| 目的片段转化连接后，挑单克隆摇菌，获得第一代菌，可是如果取第一代菌加入ＬＢ（含抗生素）再摇的话，连有目的片段的质粒会变吗？为什么我送的第一代菌液测序都挺正常的，可是第二代菌液测出来就好多不正常的呀？不是有碱基缺失就是根本找不到下游引物呢！从Ｔ载体上切目的片段，大家是不是都从第一代菌里提质粒切啊？还是可以一代一代的摇啊？ |
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lxj341401
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2楼2011-07-10 19:48:03
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gwbk
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4楼2011-07-10 21:48:28
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1949stone(EPI+1): 很好啊 学习了 2011-07-11 10:27:20
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1949stone(EPI+1): 很好啊 学习了 2011-07-11 10:27:20
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可能跟实验操作有关系，也可能跟宿主有关系，我的实验跟我的实验操作有关系，因为同样的宿主，有一株测序完全正确的。 有几点建议 1，切胶回收，凝胶拍照的时候，尽量减少紫外照射时间。我的突变是点是NNNGTTNNN，GT缺失，测序结果是NNNTNNN，怀疑跟嘧啶二聚体的形成有关。 2，实验操作该轻柔的一定不要剧烈。提质粒加NaOH时候，要求是轻摇5-8次，按照说明操作就行。 点突变可能是化学试剂、物理因素如紫外线、宿主对质粒的兼容性造成的，做实验的时候多注意点，找出自己突变的原因才是最关键的。 |
5楼2011-07-11 09:55:00
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工业用菌确实存在很多问题，免不了质粒丢失严重，高突变等现象，但是一般工业用菌都是经过10代以上稳定筛选之后才用于小试、中试和工业生产的。菌体不稳定造可能成的损失巨大，所以鲜有工业用菌使用在2-3代菌就没有产量或者产量低的菌株。一般来说，一代菌用一点少一点，一代菌上罐太伤了，工业用菌一般会存储足够量的二代菌（多数是冷冻干燥安瓿管）用于生产，在生产中需要活化、制作摇瓶种子，如果菌体生长慢，还要进一步做种子罐，最后才能用于生产。如果菌体稳定性差，几代传下来，发酵的不稳定造成损失是很难估计的，而且一般不稳定菌都是先做小试、中试，成功后才能用于生产。 质粒在宿主中的稳定性确实需要进行筛选，实验中遇到的质粒突变能避免尽量避免，做好的质粒也不一定一直存放，由于不断的被用于各种改进实验，期间经过的大量筛选，避免了一代菌用完之后就没有更好的使用。使用高保真酶扩增、保证没有物理化学因素促变，使用合适的宿主，还是很容易得到没有突变的质粒的，后续连续传代培养也可以得到比较稳定的质粒的。 |
9楼2011-07-11 22:12:29
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