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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒稳定性的问题
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friya0910

新虫 (正式写手)

[交流] 质粒稳定性的问题 已有4人参与

目的片段转化连接后，挑单克隆摇菌，获得第一代菌，可是如果取第一代菌加入ＬＢ（含抗生素）再摇的话，连有目的片段的质粒会变吗？为什么我送的第一代菌液测序都挺正常的，可是第二代菌液测出来就好多不正常的呀？不是有碱基缺失就是根本找不到下游引物呢！从Ｔ载体上切目的片段，大家是不是都从第一代菌里提质粒切啊？还是可以一代一代的摇啊？
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1楼 2011-07-10 19:27:28
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gwbk

木虫 (正式写手)
★
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1949stone(EPI+1): 很好啊 学习了 2011-07-11 10:27:20
可能跟实验操作有关系，也可能跟宿主有关系，我的实验跟我的实验操作有关系，因为同样的宿主，有一株测序完全正确的。
有几点建议
1，切胶回收，凝胶拍照的时候，尽量减少紫外照射时间。我的突变是点是NNNGTTNNN，GT缺失，测序结果是NNNTNNN，怀疑跟嘧啶二聚体的形成有关。
2，实验操作该轻柔的一定不要剧烈。提质粒加NaOH时候，要求是轻摇5-8次，按照说明操作就行。

点突变可能是化学试剂、物理因素如紫外线、宿主对质粒的兼容性造成的，做实验的时候多注意点，找出自己突变的原因才是最关键的。
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5楼2011-07-11 09:55:00
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
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1949stone(金币+1): 鼓励 鼓励 2011-07-10 20:37:08
不可能总是用第一代的呀，我们都是一代一代的摇的，没你说的问题。
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2楼2011-07-10 19:48:03
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★
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1949stone(金币+1): 学习一下 2011-07-10 20:37:20
我们也遇到过相同的问题，有些质粒只在第一代菌里面是正确的，接种之后摇出来的菌全是错误的，解决的方法是多转几种不同的感受态细胞，找出能在里面稳定克隆的菌株。
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
3楼2011-07-10 19:50:05
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gwbk

木虫 (正式写手)
★ ★
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dhd997(金币+1): 有解决办法吗 2011-07-11 07:44:08
这个确实是一个问题，我也出现了这种问题，不过是在换载体后出现的，想起来挺郁闷的。
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4楼2011-07-10 21:48:28
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