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friya0910

新虫 (正式写手)

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专业: 作物分子育种

[交流] 质粒稳定性的问题已有4人参与

目的片段转化连接后，挑单克隆摇菌，获得第一代菌，可是如果取第一代菌加入ＬＢ（含抗生素）再摇的话，连有目的片段的质粒会变吗？为什么我送的第一代菌液测序都挺正常的，可是第二代菌液测出来就好多不正常的呀？不是有碱基缺失就是根本找不到下游引物呢！从Ｔ载体上切目的片段，大家是不是都从第一代菌里提质粒切啊？还是可以一代一代的摇啊？

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1楼 2011-07-10 19:27:28

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gwbk

木虫 (正式写手)

MolEPI: 54
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专业: 生物化学

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(EPI+1): 很好啊学习了 2011-07-11 10:27:20

可能跟实验操作有关系，也可能跟宿主有关系，我的实验跟我的实验操作有关系，因为同样的宿主，有一株测序完全正确的。
有几点建议
1，切胶回收，凝胶拍照的时候，尽量减少紫外照射时间。我的突变是点是NNNGTTNNN，GT缺失，测序结果是NNNTNNN，怀疑跟嘧啶二聚体的形成有关。
2，实验操作该轻柔的一定不要剧烈。提质粒加NaOH时候，要求是轻摇5-8次，按照说明操作就行。

点突变可能是化学试剂、物理因素如紫外线、宿主对质粒的兼容性造成的，做实验的时候多注意点，找出自己突变的原因才是最关键的。