| 查看: 3953 | 回复: 15 | ||
houjinglhy荣誉版主 (文坛精英)
表达自由，人权之基。
|
[求助]
CHO细胞中，G418加压筛选与DHFR系统加压筛选的区别？
|
|
最近在做CHO细胞的加压筛选，有几个问题想请教。 1、G418筛选和MTX的DHFR系统筛选有什么区别？ 查到的文献是这么说的： “DHFR基因连同其附近几千KB的DNA还会扩增以满足核苷酸合成的需要” 那么，G418加压筛选是什么原理？也能够使转染基因的拷贝数增加吗？ 2、加压筛选的具体步骤是怎么样的？ a、将载体转化CHO细胞后，直接铺板筛选单克隆，至每一个well中有一个细胞。 然后再拿这个细胞扩大培养继续单克隆筛选。 B、将载体转化CHO细胞后，分成若干等份（多克隆）培养，逐步对这些等份的多克隆加压。 通过多次加压后，最后一步再进行单克隆化 到底是那种策略呢？（ a 还是B） 3、已经整合到基因组上的基因还能够通过加压来增加拷贝数吗？（G418 or MTX） 那这个加压是什么原理？貌似跟1重复了 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有76人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
chlorella409
木虫 (正式写手)
- 应助: 88 (初中生)
- 金币: 3245.6
- 散金: 1000
- 红花: 4
- 帖子: 376
- 在线: 182.4小时
- 虫号: 1600249
- 注册: 2012-02-05
- 性别: GG
- 专业: 蛋白质组学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
houjinglhy: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢！可能我问题没提清楚 我是想问NEO基因和DHFR基因整合到基因组上后是否能够再通过加压扩增 2013-11-27 15:12:41
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-11-27 16:01:41
感谢参与，应助指数 +1
houjinglhy: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢！可能我问题没提清楚 我是想问NEO基因和DHFR基因整合到基因组上后是否能够再通过加压扩增 2013-11-27 15:12:41
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-11-27 16:01:41
|
1.g418筛选是通过NEO基因来实现的，一般CHO本身都不带G418抗性，通过转染将带有目的基因和NEO基因的质粒转染到细胞内，就使细胞带有抗性了，在通过筛选就能获取表达目的基因的细胞。DHFR缺陷型CHO是人为改造的，没有二氢叶酸还原酶，转染加入带有DHFR基因就可以用MTX筛选，所以DHFR的CHO也可以用G418 筛选。 2.加压筛选前首先要用G418筛选CHO本身的最大抑制浓度，转染后再用最大抑制浓度的G418筛选，经过一定的周期就会得到具有G418抗性的细胞，要得到表达稳定的单克隆细胞株还要采用极限稀释的手段。 3.已经整合的基因在传代过程中，有一定程度的会丢失，所以只要不表达蛋白，一般传代都加上筛选压力，保持细胞的稳定性 |
2楼2013-11-27 13:11:11
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
houjinglhy: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 已经整合到基因组上的DHFR基因还能扩增？这个是什么原理呢？ 2013-11-27 15:09:59
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-11-27 16:01:48
感谢参与，应助指数 +1
houjinglhy: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 已经整合到基因组上的DHFR基因还能扩增？这个是什么原理呢？ 2013-11-27 15:09:59
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-11-27 16:01:48
| G418不能提高拷贝数，只能筛选含有NEO基因的细胞，将无NEO基因的细胞杀死，DHFR通过浓度的加压，带动两侧的基因扩增，但是在DHRF缺陷的细胞才能使用，上述两种筛选都需要挑选稳定细胞克隆，建立细胞系，并且需要确定细胞系在无压力或低压力的条件下稳定表达目的基因 |
3楼2013-11-27 13:18:50
★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-11-27 16:01:52
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-11-27 16:01:52
|
本帖内容被屏蔽 |
4楼2013-11-27 14:50:37
houjinglhy
荣誉版主 (文坛精英)
表达自由，人权之基。
- 应助: 21 (小学生)
- 贵宾: 0.911
- 金币: 5168.5
- 散金: 3205
- 红花: 137
- 沙发: 93
- 帖子: 10564
- 在线: 913.2小时
- 虫号: 461324
- 注册: 2007-11-18
- 专业: 生物技术药物
- 管辖: 公派出国
5楼2013-11-27 15:07:43
|
本帖内容被屏蔽 |
6楼2013-11-27 15:52:41
houjinglhy
荣誉版主 (文坛精英)
表达自由，人权之基。
- 应助: 21 (小学生)
- 贵宾: 0.911
- 金币: 5168.5
- 散金: 3205
- 红花: 137
- 沙发: 93
- 帖子: 10564
- 在线: 913.2小时
- 虫号: 461324
- 注册: 2007-11-18
- 专业: 生物技术药物
- 管辖: 公派出国
7楼2013-11-27 16:20:36
|
本帖内容被屏蔽 |
8楼2013-11-27 16:54:00
houjinglhy
荣誉版主 (文坛精英)
表达自由，人权之基。
- 应助: 21 (小学生)
- 贵宾: 0.911
- 金币: 5168.5
- 散金: 3205
- 红花: 137
- 沙发: 93
- 帖子: 10564
- 在线: 913.2小时
- 虫号: 461324
- 注册: 2007-11-18
- 专业: 生物技术药物
- 管辖: 公派出国
9楼2013-11-27 17:14:09
|
本帖内容被屏蔽 |
10楼2013-11-27 18:21:17
20