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houjinglhy荣誉版主 (文坛精英)
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[求助]
CHO细胞中，G418加压筛选与DHFR系统加压筛选的区别？
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最近在做CHO细胞的加压筛选，有几个问题想请教。 1、G418筛选和MTX的DHFR系统筛选有什么区别？ 查到的文献是这么说的： “DHFR基因连同其附近几千KB的DNA还会扩增以满足核苷酸合成的需要” 那么，G418加压筛选是什么原理？也能够使转染基因的拷贝数增加吗？ 2、加压筛选的具体步骤是怎么样的？ a、将载体转化CHO细胞后，直接铺板筛选单克隆，至每一个well中有一个细胞。 然后再拿这个细胞扩大培养继续单克隆筛选。 B、将载体转化CHO细胞后，分成若干等份（多克隆）培养，逐步对这些等份的多克隆加压。 通过多次加压后，最后一步再进行单克隆化 到底是那种策略呢？（ a 还是B） 3、已经整合到基因组上的基因还能够通过加压来增加拷贝数吗？（G418 or MTX） 那这个加压是什么原理？貌似跟1重复了 |
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8楼2013-11-27 16:54:00
chlorella409
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
houjinglhy: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢！可能我问题没提清楚 我是想问NEO基因和DHFR基因整合到基因组上后是否能够再通过加压扩增 2013-11-27 15:12:41
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-11-27 16:01:41
感谢参与，应助指数 +1
houjinglhy: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢！可能我问题没提清楚 我是想问NEO基因和DHFR基因整合到基因组上后是否能够再通过加压扩增 2013-11-27 15:12:41
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-11-27 16:01:41
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1.g418筛选是通过NEO基因来实现的，一般CHO本身都不带G418抗性，通过转染将带有目的基因和NEO基因的质粒转染到细胞内，就使细胞带有抗性了，在通过筛选就能获取表达目的基因的细胞。DHFR缺陷型CHO是人为改造的，没有二氢叶酸还原酶，转染加入带有DHFR基因就可以用MTX筛选，所以DHFR的CHO也可以用G418 筛选。 2.加压筛选前首先要用G418筛选CHO本身的最大抑制浓度，转染后再用最大抑制浓度的G418筛选，经过一定的周期就会得到具有G418抗性的细胞，要得到表达稳定的单克隆细胞株还要采用极限稀释的手段。 3.已经整合的基因在传代过程中，有一定程度的会丢失，所以只要不表达蛋白，一般传代都加上筛选压力，保持细胞的稳定性 |
2楼2013-11-27 13:11:11
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
houjinglhy: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 已经整合到基因组上的DHFR基因还能扩增？这个是什么原理呢？ 2013-11-27 15:09:59
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-11-27 16:01:48
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houjinglhy: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 已经整合到基因组上的DHFR基因还能扩增？这个是什么原理呢？ 2013-11-27 15:09:59
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-11-27 16:01:48
| G418不能提高拷贝数，只能筛选含有NEO基因的细胞，将无NEO基因的细胞杀死，DHFR通过浓度的加压，带动两侧的基因扩增，但是在DHRF缺陷的细胞才能使用，上述两种筛选都需要挑选稳定细胞克隆，建立细胞系，并且需要确定细胞系在无压力或低压力的条件下稳定表达目的基因 |
3楼2013-11-27 13:18:50
★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-11-27 16:01:52
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-11-27 16:01:52
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4楼2013-11-27 14:50:37
