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youngsun50

木虫 (正式写手)

[交流] 基因组文库构建时DNA酶切片段用胶回收吗？

RT，我构建的是细菌的基因组文库，基因组DNA BamHI酶切后显示大多在3K-7K,少数<3K,请问
1）我还用选择性的胶回收某个范围大小的片段吗，因为我也不知道我要的基因在多大片段上？
2）如果不回收的话怎么处理酶切后产物进行连接反应（用pUC19载体），我看有65度5min灭活限制酶的，可行吗？
谢谢，请大侠指点

[ Last edited by youngsun50 on 2012-1-2 at 10:18 ]
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1楼2012-01-01 17:25:09
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
youngsun50(金币+1): 2012-01-02 21:08:08
西瓜(金币+1): 老专家，常来啊~ 2012-01-03 08:33:49
文库构建时尽量用较大的片段，切胶回收没商量。
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2楼2012-01-02 18:54:44
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quiller2000

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
youngsun50(金币+1): 2012-01-02 21:08:20
西瓜(金币+1): 欢迎常来~ 2012-01-03 08:32:48
你要先调查一下你的基因组中一般情况下基因的大小；一般都要用胶回收！
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3楼2012-01-02 20:10:23
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youngsun50

木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by brightfuture01 at 2012-01-02 18:54:44:
文库构建时尽量用较大的片段，切胶回收没商量。

但我怕漏掉小片段啊，能用PCR回收试剂盒把所有的片段都回收做连接吗，小片段对连接没影响吧？
另，pUC载体最大能插入多大的片段啊？谢谢
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4楼2012-01-02 20:57:01
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+1, 专家考核): Good！ 2012-01-03 08:33:15
youngsun50(金币+2): 2012-01-11 17:08:58
引用回帖:
4楼: Originally posted by youngsun50 at 2012-01-02 20:57:01:
但我怕漏掉小片段啊，能用PCR回收试剂盒把所有的片段都回收做连接吗，小片段对连接没影响吧？
另，pUC载体最大能插入多大的片段啊？谢谢

  <10kb, 你需要补充下文库质量评价方面的知识。

有一个概念你需要自己查一下：覆盖度
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5楼2012-01-02 23:17:07
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jjdd55

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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西瓜(金币+2): 鼓励应助！欢迎常来哦~ 2012-01-04 12:11:28
可以直接连接试试 效果不好的话 用PCR产物纯化试剂盒直接纯化就可以了（qiagen有一个 50次 1000 挺不错） 回收大于100bp的片段
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6楼2012-01-04 00:18:12
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youngsun50

木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by brightfuture01 at 2012-01-02 23:17:07:
  <10kb, 你需要补充下文库质量评价方面的知识。

有一个概念你需要自己查一下：覆盖度

谢谢！再请教几个问题：
1)酶切时是不完全酶切吗，我用的六碱基酶切过夜，结果小于2K的也有，并不集中在3k-8k间，我这样是不是不行啊?
2)一般构建文库需要DNA片段多少啊，0.1pmol够吗
3)转化一般要涂多少个板子啊才能筛到自己想要的
我第一次做，实验室也没做过的，问题有点多希望不要烦，最好能说一下各个步骤的注意心得啥的，谢谢高手了！！
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7楼2012-01-11 17:16:52
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
小丹木木(金币+1): 回答的很艺术，也很简单明了哦 2012-01-12 08:34:18
youngsun50(金币+1): 2012-02-16 22:06:14
引用回帖:
7楼: Originally posted by youngsun50 at 2012-01-11 17:16:52:
谢谢！再请教几个问题：
1)酶切时是不完全酶切吗，我用的六碱基酶切过夜，结果小于2K的也有，并不集中在3k-8k间，我这样是不是不行啊?
2)一般构建文库需要DNA片段多少啊，0.1pmol够吗
3)转化一般要涂多少个板 ...

1)酶切时是不完全酶切吗，我用的六碱基酶切过夜，结果小于2K的也有，并不集中在3k-8k间，我这样是不是不行啊?
不完全酶切。

2)一般构建文库需要DNA片段多少啊，0.1pmol够吗
不够。

3)转化一般要涂多少个板子啊才能筛到自己想要的
运气有的时候很重要。

我第一次做，实验室也没做过的，问题有点多希望不要烦，最好能说一下各个步骤的注意心得啥的，谢谢高手了！！
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8楼2012-01-11 17:25:15
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