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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因组文库构建时DNA酶切片段用胶回收吗？
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youngsun50

木虫 (正式写手)

[交流] 基因组文库构建时DNA酶切片段用胶回收吗？

RT，我构建的是细菌的基因组文库，基因组DNA BamHI酶切后显示大多在3K-7K,少数<3K,请问
1）我还用选择性的胶回收某个范围大小的片段吗，因为我也不知道我要的基因在多大片段上？
2）如果不回收的话怎么处理酶切后产物进行连接反应（用pUC19载体），我看有65度5min灭活限制酶的，可行吗？
谢谢，请大侠指点

[ Last edited by youngsun50 on 2012-1-2 at 10:18 ]
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1楼 2012-01-01 17:25:09
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youngsun50

木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by brightfuture01 at 2012-01-02 18:54:44:
文库构建时尽量用较大的片段，切胶回收没商量。

但我怕漏掉小片段啊，能用PCR回收试剂盒把所有的片段都回收做连接吗，小片段对连接没影响吧？
另，pUC载体最大能插入多大的片段啊？谢谢
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4楼2012-01-02 20:57:01
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youngsun50

木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by brightfuture01 at 2012-01-02 23:17:07:
  <10kb, 你需要补充下文库质量评价方面的知识。

有一个概念你需要自己查一下：覆盖度

谢谢！再请教几个问题：
1)酶切时是不完全酶切吗，我用的六碱基酶切过夜，结果小于2K的也有，并不集中在3k-8k间，我这样是不是不行啊?
2)一般构建文库需要DNA片段多少啊，0.1pmol够吗
3)转化一般要涂多少个板子啊才能筛到自己想要的
我第一次做，实验室也没做过的，问题有点多希望不要烦，最好能说一下各个步骤的注意心得啥的，谢谢高手了！！
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7楼2012-01-11 17:16:52
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