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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 【求助/交流】PCR--小弟上图了，帮我看看图
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feiye2214

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR--小弟上图了，帮我看看图 已有17人参与


这是我用其他物种唐鱼、鲤鱼的目的基因片段的引物去扩乌贼的这个目的片段，出现了很多条带（还有很多的相关引物正在做，先做的这两条），目的片段是b-actin，应该还算保守吧？
图：上面是唐鱼，下面是鲤鱼
从左至右是45-65度的退火温度梯度
本人觉得是引物特异性不高，因为前面45度时条带很多，到后面的65度又没有条带出现。
高手帮我出出主意，怎么能增加特异性扩增？

[ Last edited by feiye2214 on 2010-12-9 at 21:52 ]
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1楼 2010-12-09 21:27:31
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
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silicare(金币+1): 2010-12-28 14:04:20
乍一看还以为是筛ssr呢    引物特异性太低，重设计吧
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2楼2010-12-09 22:20:59
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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引物特异性太差，另外可以试试touchdownPCR。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2010-12-09 22:27:56
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scelab

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Originally posted by feiye2214 at 2010-12-09 21:27:31:
[img]这是我用其他物种唐鱼、鲤鱼的目的基因片段的引物去扩乌贼的这个目的片段，出现了很多条带（还有很多的相关引物正在做，先做的这两条），目的片段是 ...

很漂亮的说，请问你是什么marker，多大的胶？
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小木虫之有关部门负责人
4楼2010-12-09 22:32:15
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feiye2214

木虫 (正式写手)
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Originally posted by scelab at 2010-12-09 22:32:15:

很漂亮的说，请问你是什么marker，多大的胶？

胶是10cm左右长宽，M是宝生物的100-6000 wide range Marker
给我点建议哈？
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5楼2010-12-09 22:52:46
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feiye2214

木虫 (正式写手)
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Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-09 22:27:56:
引物特异性太差，另外可以试试touchdownPCR。

touchdownPCR原理算是明白了，但是实验室没有人做过这个，一般的PCR仪就可以做吗？

[ Last edited by feiye2214 on 2010-12-9 at 23:08 ]
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6楼2010-12-09 23:02:38
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scelab

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Originally posted by feiye2214 at 2010-12-09 22:52:46:

胶是10cm左右长宽，M是宝生物的100-6000 wide range Marker
给我点建议哈？

胶浓度时多少
pcr偶做的少，帮不上忙~~~
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7楼2010-12-09 23:06:57
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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scelab(金币+3):谢谢交流！:tiger06: 2010-12-09 23:26:32
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Originally posted by feiye2214 at 2010-12-09 23:02:38:

touchdownPCR原理算是明白了，但是实验室没有人做过这个，一般的PCR就可以做吗？

能做梯度的那种PCR仪程序设置起来很方便，每个循环升一点。不能这样设置的就得设置N次了。东盛 龙 的那个叫黑金刚的用起来还是很不错的。
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8楼2010-12-09 23:08:40
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feiye2214

木虫 (正式写手)
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Originally posted by scelab at 2010-12-09 23:06:57:

胶浓度时多少
pcr偶做的少，帮不上忙~~~

1% AGE 0.5×TBE
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9楼2010-12-09 23:09:11
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scelab

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Originally posted by feiye2214 at 2010-12-09 23:09:11:

1% AGE 0.5×TBE

呵呵，我用0.75的，1×TAE，每次跑出来的都很难看
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10楼2010-12-09 23:27:16
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