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双酶切连接不成功 已有7人参与
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双酶切连接这么难吗，怎么就连不上！目的片段3300，载体3000，酶是NEB的。,双酶切后10ulT4连接体系，体积比设了好几个，转化子长了好多，挑菌，菌液PCR都是假阳性，欲哭无泪( ˙-˙ )，该怎么办？   发自小木虫Android客户端 |
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kangaroo0513
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4楼2017-05-30 22:32:27
5楼2017-05-30 22:48:06
原来，是这样
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-02 22:42:53
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-02 22:42:53
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目的片段大于两千就已经很难连接了，更何况是3300的片段。。。体积比还是要看你的片段及载体浓度，目的片段和载体浓度都不能低，10ul的体系DNA总量最好不要少于1mg。 发自小木虫Android客户端 |
6楼2017-05-30 23:10:49
wangxiaoguo
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14楼2017-05-31 22:11:37
wangxiaoguo
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第二，酶切和连接时间最好长一些。一般双酶切出现假阳性的话，很可能是酶切不是很完全。如果两个酶位点太近的话会有位置效应的。另外，确认一下你检测的引物是唯一的。要不可能会出现扩增的并不是目的片段长度，但实际上确连好了 发自小木虫Android客户端 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
我好暴躁啊15楼2017-05-31 22:15:16
lusandanooo
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7楼2017-05-31 07:57:11
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18楼2017-06-01 16:05:37
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32楼2017-06-02 14:53:29
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34楼2017-06-02 15:19:34
2楼2017-05-30 22:01:09
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8楼2017-05-31 08:22:12
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回收片段测浓度确实260/230不好，260都没有峰值。我是第一个酶切后65度灭火20min，然后直接加第二个酶，可是回收的时候浓度还是很低。切3ug，回收了60ng。T_T 发自小木虫Android客户端 |
9楼2017-05-31 08:49:05
我问师兄，他说没做过
，连接体系我再优化一下，还有大神我怎么设置对照？ 10楼2017-05-31 09:14:40
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