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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切连接不成功
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ganzuofei

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 我好暴躁啊 at 2017-05-31 08:49:05
回收片段测浓度确实260/230不好，260都没有峰值。我是第一个酶切后65度灭火20min，然后直接加第二个酶，可是回收的时候浓度还是很低。切3ug，回收了60ng。T_T
...

这片段有问题，制备好片段再连接，你片段和载体链接体系配成1:1摩尔比肯定ok，正常连接22度一小时，适当延长到1.5-2小时，另确定是否用了xba1这类甲基化没切位点，xba1甲基化无法切开。还有你的胶回收有问题，3ug最好分3孔跑，胶浓度别太大容易堵孔影响回收，胶多融一会儿没事要确保溶解充分，实验成败在于细节不在于难易，3ug到60ng肯定有问题的。还有就是鉴定用的酶，三千用普通rtaq出现过有的鉴定不出来，换酶试一试就出来了。也可以提两个质粒酶切鉴定你的可以不酶切直接跑质粒鉴定，或在片段上挖个下游引物只要鉴定切口处有连接上也可以，大片段连接不上的原因很多，建议往前往后都做验证尝试。连接片段物质的量一般在0.001-0.003pm之间。具体到你3000片段长度就是60-180ng之间。

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在南宁上学
41楼2017-06-03 21:30:20
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虫卜1988

新虫 (著名写手)
你换TAKARA的T4酶或者solution one的连接酶。片段和载体比例差不多1:1，4度过夜。保证连上。。。载体构建我做得非常多。5千多的片段连10000的载体我也一次做出来。NEB的酶全球最好，也很贵，用的唯一方便就是它连接时间短。但是，稍微时间过长或者操作不当，假阳性非常严重。

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42楼2017-06-03 22:11:52
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虫卜1988

新虫 (著名写手)
此外，看你的图片，大菌落边上有小点，培养时间也长了。抗生素失效也很容易有非阳性克隆出来

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43楼2017-06-03 22:14:13
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李逆熵

新虫 (正式写手)
3300太长了

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44楼2017-06-03 22:38:45
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曾文正公

金虫 (著名写手)
应该是你选的两个酶切位点不合适，导致全是自连产物，建议更换酶切位点，用新引物试试，祝你成功

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只有非常努力，才能看起来毫不费力
45楼2017-06-04 11:33:37
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匿名

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小虫
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46楼2017-06-04 12:08:13
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匿名

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小虫
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47楼2017-06-04 12:15:26
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晨晨330


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48楼2017-06-04 12:44:10
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我好暴躁啊

新虫 (小有名气)
引用回帖:
39楼: Originally posted by 原来，是这样 at 2017-06-02 23:29:56
和我猜想的一样，你回收浓度太低了，才60ng，完全配不出一个好体系。胶回收的时候溶胶液重复过柱3次，洗脱液也过柱2次，片段3000多才60多ng，mol数也就很低了，自然就会形成空载了。然后就是你为什么要单酶切之后灭 ...

一样的，都是37度

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49楼2017-06-05 10:03:20
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我好暴躁啊

新虫 (小有名气)
引用回帖:
42楼: Originally posted by 虫卜1988 at 2017-06-03 22:11:52
你换TAKARA的T4酶或者solution one的连接酶。片段和载体比例差不多1:1，4度过夜。保证连上。。。载体构建我做得非常多。5千多的片段连10000的载体我也一次做出来。NEB的酶全球最好，也很贵，用的唯一方便就是它连接 ...

好厉害，抱大腿

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50楼2017-06-05 10:05:09
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