24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 7238  |  回复: 52

ganzuofei

版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 我好暴躁啊 at 2017-05-31 08:49:05
回收片段测浓度确实260/230不好,260都没有峰值。我是第一个酶切后65度灭火20min,然后直接加第二个酶,可是回收的时候浓度还是很低。切3ug,回收了60ng。T_T
...

这片段有问题,制备好片段再连接,你片段和载体链接体系配成1:1摩尔比肯定ok,正常连接22度一小时,适当延长到1.5-2小时,另确定是否用了xba1这类甲基化没切位点,xba1甲基化无法切开。还有你的胶回收有问题,3ug最好分3孔跑,胶浓度别太大容易堵孔影响回收,胶多融一会儿没事要确保溶解充分,实验成败在于细节不在于难易,3ug到60ng肯定有问题的。还有就是鉴定用的酶,三千用普通rtaq出现过有的鉴定不出来,换酶试一试就出来了。也可以提两个质粒酶切鉴定你的可以不酶切直接跑质粒鉴定,或在片段上挖个下游引物只要鉴定切口处有连接上也可以,大片段连接不上的原因很多,建议往前往后都做验证尝试。连接片段物质的量一般在0.001-0.003pm之间。具体到你3000片段长度就是60-180ng之间。

发自小木虫IOS客户端
在南宁上学
41楼2017-06-03 21:30:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

虫卜1988

兑换贵宾

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

你换TAKARA的T4酶或者solution one的连接酶。片段和载体比例差不多1:1,4度过夜。保证连上。。。载体构建我做得非常多。5千多的片段连10000的载体我也一次做出来。NEB的酶全球最好,也很贵,用的唯一方便就是它连接时间短。但是,稍微时间过长或者操作不当,假阳性非常严重。

发自小木虫Android客户端
42楼2017-06-03 22:11:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

虫卜1988

管理员

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

此外,看你的图片,大菌落边上有小点,培养时间也长了。抗生素失效也很容易有非阳性克隆出来

发自小木虫Android客户端
43楼2017-06-03 22:14:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

李逆熵

兑换贵宾

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

44楼2017-06-03 22:38:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

曾文正公

专家顾问

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

应该是你选的两个酶切位点不合适,导致全是自连产物,建议更换酶切位点,用新引物试试,祝你成功

发自小木虫Android客户端
只有非常努力,才能看起来毫不费力
45楼2017-06-04 11:33:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

专家顾问

小虫

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

本帖仅楼主可见
46楼2017-06-04 12:08:13
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

匿名

实习版主

小虫

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

本帖仅楼主可见
47楼2017-06-04 12:15:26
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

晨晨330

管理员

48楼2017-06-04 12:44:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我好暴躁啊

版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

引用回帖:
39楼: Originally posted by 原来,是这样 at 2017-06-02 23:29:56
和我猜想的一样,你回收浓度太低了,才60ng,完全配不出一个好体系。胶回收的时候溶胶液重复过柱3次,洗脱液也过柱2次,片段3000多才60多ng,mol数也就很低了,自然就会形成空载了。然后就是你为什么要单酶切之后灭 ...

一样的,都是37度

发自小木虫Android客户端
49楼2017-06-05 10:03:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我好暴躁啊

兑换贵宾

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

引用回帖:
42楼: Originally posted by 虫卜1988 at 2017-06-03 22:11:52
你换TAKARA的T4酶或者solution one的连接酶。片段和载体比例差不多1:1,4度过夜。保证连上。。。载体构建我做得非常多。5千多的片段连10000的载体我也一次做出来。NEB的酶全球最好,也很贵,用的唯一方便就是它连接 ...

好厉害,抱大腿

发自小木虫Android客户端
50楼2017-06-05 10:05:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 我好暴躁啊 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 271求调剂 +9 勒布朗@ 2026-03-31 11/550 2026-04-01 01:32 by 1018329917
[考研] 省双一流重点一本大学招收调剂 +3 wwwwffffff 2026-03-31 5/250 2026-03-31 19:49 by 曾曾曾!
[考研] 本2一志愿C9-333分,材料科学与工程,求调剂 +9 升升不降 2026-03-31 9/450 2026-03-31 18:01 by 无际的草原
[考研] 生物学296求调剂 +8 汤圆包 2026-03-29 12/600 2026-03-31 17:05 by 18828373951
[考研] 材料求调剂 一志愿哈工大总分298分,前三科223分 +11 dongfang59 2026-03-27 11/550 2026-03-31 16:51 by Wang200018
[考研] 362求调剂 +9 西南交材料专硕3 2026-03-31 9/450 2026-03-31 16:25 by w虫虫123
[基金申请] 面上5B能上会吗? +8 redcom 2026-03-29 8/400 2026-03-31 15:53 by niuailing
[考研] 生物学 296 求调剂 +7 朵朵- 2026-03-26 9/450 2026-03-31 14:26 by jp9609
[考研] 313求调剂 +6 卖个关子吧 2026-03-31 6/300 2026-03-31 10:58 by Jaylen.
[考研] 总分322求生物学/生化与分子/生物信息学相关调剂 +6 星沉uu 2026-03-26 7/350 2026-03-31 10:19 by GdShizy
[考研] 一志愿食品科学与工程083200求调剂 +4 XQTJZ 2026-03-30 4/200 2026-03-31 04:10 by fmesaito
[考研] 哈尔滨工业大学材料与化工专硕378求调剂 +3 塔比乌斯 2026-03-30 3/150 2026-03-30 22:55 by 无际的草原
[考研] 303求调剂 +7 DLkz1314. 2026-03-30 7/350 2026-03-30 21:07 by peike
[考研] 312,生物学求调剂 +3 小译同学abc 2026-03-28 3/150 2026-03-28 15:32 by 落睿可思
[考研] 352分 化工与材料 +5 海纳百川Ly 2026-03-27 5/250 2026-03-28 03:39 by fmesaito
[考研] 265求调剂 +8 小木虫085600 2026-03-27 8/400 2026-03-27 22:16 by 无际的草原
[考研] 0703化学求调剂,各位老师看看我!!! +5 祁祺祺 2026-03-25 5/250 2026-03-27 21:44 by 东方猪猪
[考研] 348求调剂 +4 小懒虫不懒了 2026-03-27 5/250 2026-03-27 12:47 by 果果妈咪
[考研] 298调剂 +3 jiyingjie123 2026-03-27 3/150 2026-03-27 11:57 by wxiongid
[考研] 打过很多竞赛,085406控制工程300分,求调剂 +3 askeladz 2026-03-26 3/150 2026-03-26 09:08 by 给你你注意休息
信息提示
请填处理意见