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我好暴躁啊

新虫 (小有名气)

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[求助] 双酶切连接不成功已有7人参与

双酶切连接这么难吗，怎么就连不上！目的片段3300，载体3000，酶是NEB的。,双酶切后10ulT4连接体系，体积比设了好几个，转化子长了好多，挑菌，菌液PCR都是假阳性，欲哭无泪( ˙-˙ )，该怎么办？

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1楼 2017-05-30 21:44:31

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ganzuofei

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

引用回帖:

9楼: Originally posted by 我好暴躁啊 at 2017-05-31 08:49:05
回收片段测浓度确实260/230不好，260都没有峰值。我是第一个酶切后65度灭火20min，然后直接加第二个酶，可是回收的时候浓度还是很低。切3ug，回收了60ng。T_T
...

这片段有问题，制备好片段再连接，你片段和载体链接体系配成1:1摩尔比肯定ok，正常连接22度一小时，适当延长到1.5-2小时，另确定是否用了xba1这类甲基化没切位点，xba1甲基化无法切开。还有你的胶回收有问题，3ug最好分3孔跑，胶浓度别太大容易堵孔影响回收，胶多融一会儿没事要确保溶解充分，实验成败在于细节不在于难易，3ug到60ng肯定有问题的。还有就是鉴定用的酶，三千用普通rtaq出现过有的鉴定不出来，换酶试一试就出来了。也可以提两个质粒酶切鉴定你的可以不酶切直接跑质粒鉴定，或在片段上挖个下游引物只要鉴定切口处有连接上也可以，大片段连接不上的原因很多，建议往前往后都做验证尝试。连接片段物质的量一般在0.001-0.003pm之间。具体到你3000片段长度就是60-180ng之间。

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