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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切连接不成功
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enjoy大志

铜虫 (小有名气)
目的片段拆开连

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付出定有回报
31楼2017-06-02 14:53:25
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贱贱JMe

木虫 (小有名气)

教导主任

【答案】应助回帖

引用回帖:
28楼: Originally posted by 我好暴躁啊 at 2017-06-02 12:50:24
我是本科实习新手，求教一部克隆是什么
...

In-Fusion试剂盒或者无缝克隆试剂盒，就是你说的同源重组，你的片段较大，应该也可以，咨询一下厂家，2K以内效率极高
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想做一位科研好人
32楼2017-06-02 14:53:29
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幸福的被等

新虫 (初入文坛)
试一试含top异构酶的载体，不是T4连接酶，top异构酶连接类似化学反应，只要在抗性平板上长出来的基本就是阳性克隆子，连接的时候比说明书的标准时间稍微延长一点，增加连接效率。

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33楼2017-06-02 15:12:50
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最美的平凡

铁虫 (正式写手)
换一种方式吧，市场上现在比较流行同源重组克隆，有的叫无缝拼接，效率很高

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学术狗
34楼2017-06-02 15:19:34
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我好暴躁啊

新虫 (小有名气)
引用回帖:
32楼: Originally posted by 贱贱JMe at 2017-06-02 14:53:29
In-Fusion试剂盒或者无缝克隆试剂盒，就是你说的同源重组，你的片段较大，应该也可以，咨询一下厂家，2K以内效率极高...

好的谢谢啦，同源重组也在做

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35楼2017-06-02 17:03:48
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gw254404163

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
24楼: Originally posted by 我好暴躁啊 at 2017-06-02 12:45:53
同源重组做过，就是不好连，所以每种都试试，先把传统的酶切连接做好，是这么想。
...

有个近岸生物的重组酶，推荐

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36楼2017-06-02 18:32:51
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ziyya

金虫 (正式写手)
用TAKARA的ligation mix试试，个人感觉比T4好用

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春华不若秋实
37楼2017-06-02 20:41:33
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Ivy尘

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

确认载体酶切完全，宁可内切酶过量一点，因为载体一般是清洁回收，混进没切好的质粒就会造成假阳性。

唉，一把辛酸泪。。。
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38楼2017-06-02 22:18:05
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原来，是这样

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 我好暴躁啊 at 2017-05-31 08:49:05
回收片段测浓度确实260/230不好，260都没有峰值。我是第一个酶切后65度灭火20min，然后直接加第二个酶，可是回收的时候浓度还是很低。切3ug，回收了60ng。T_T
...

和我猜想的一样，你回收浓度太低了，才60ng，完全配不出一个好体系。胶回收的时候溶胶液重复过柱3次，洗脱液也过柱2次，片段3000多才60多ng，mol数也就很低了，自然就会形成空载了。然后就是你为什么要单酶切之后灭活再切呢，两个酶温度不一样需要分步切的话没必要灭活的。

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39楼2017-06-02 23:29:56
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hzau103

新虫 (正式写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by 我好暴躁啊 at 2017-06-02 12:50:24
我是本科实习新手，求教一部克隆是什么
...

试剂盒

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40楼2017-06-03 16:28:39
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