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我好暴躁啊

新虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 86.3
帖子: 93
在线: 34小时
虫号: 6457835
注册: 2017-05-05
性别: MM
专业: 疫苗学

[求助] 双酶切连接不成功已有7人参与

双酶切连接这么难吗，怎么就连不上！目的片段3300，载体3000，酶是NEB的。,双酶切后10ulT4连接体系，体积比设了好几个，转化子长了好多，挑菌，菌液PCR都是假阳性，欲哭无泪( ˙-˙ )，该怎么办？

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1楼 2017-05-30 21:44:31

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

原来，是这样

金虫 (小有名气)

应助: 2 (幼儿园)
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性别: GG
专业: 抗肿瘤药物药理

【答案】应助回帖

引用回帖:

9楼: Originally posted by 我好暴躁啊 at 2017-05-31 08:49:05
回收片段测浓度确实260/230不好，260都没有峰值。我是第一个酶切后65度灭火20min，然后直接加第二个酶，可是回收的时候浓度还是很低。切3ug，回收了60ng。T_T
...

和我猜想的一样，你回收浓度太低了，才60ng，完全配不出一个好体系。胶回收的时候溶胶液重复过柱3次，洗脱液也过柱2次，片段3000多才60多ng，mol数也就很低了，自然就会形成空载了。然后就是你为什么要单酶切之后灭活再切呢，两个酶温度不一样需要分步切的话没必要灭活的。

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