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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切连接不成功
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gw254404163

新虫 (正式写手)
不要用链接的方法，用同源重组的方法效率很高

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21楼2017-06-01 23:37:07
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蓝马追风

新虫 (小有名气)
1、确定确实切开了(片段如果PCR扩增得到，没加保护碱基，酶切效率是很低的)；2、连接时，片段和载体摩尔比控制在5-10；3、只用菌落PCR可能没鉴定出来。实在不行可以先连T载，再切

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22楼2017-06-02 00:18:38
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bjman10016

至尊木虫 (著名写手)
用的啥酶呢？

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23楼2017-06-02 04:49:52
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我好暴躁啊

新虫 (小有名气)
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21楼: Originally posted by gw254404163 at 2017-06-01 23:37:07
不要用链接的方法，用同源重组的方法效率很高

同源重组做过，就是不好连，所以每种都试试，先把传统的酶切连接做好，是这么想。

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24楼2017-06-02 12:45:53
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我好暴躁啊

新虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 蓝马追风 at 2017-06-02 00:18:38
1、确定确实切开了(片段如果PCR扩增得到，没加保护碱基，酶切效率是很低的)；2、连接时，片段和载体摩尔比控制在5-10；3、只用菌落PCR可能没鉴定出来。实在不行可以先连T载，再切
...

T载也在做，不造哪步错了也不好连

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25楼2017-06-02 12:46:37
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我好暴躁啊

新虫 (小有名气)
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23楼: Originally posted by bjman10016 at 2017-06-02 04:49:52
用的啥酶呢？

PacⅠ和 XmaⅠ NEB的

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26楼2017-06-02 12:48:17
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我好暴躁啊

新虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 蓝马追风 at 2017-06-02 00:18:38
1、确定确实切开了(片段如果PCR扩增得到，没加保护碱基，酶切效率是很低的)；2、连接时，片段和载体摩尔比控制在5-10；3、只用菌落PCR可能没鉴定出来。实在不行可以先连T载，再切
...

保护碱基，我问问师兄

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27楼2017-06-02 12:48:55
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我好暴躁啊

新虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by lusandanooo at 2017-06-01 20:58:47
用一部克隆吧，就国产的，好用的不行，我之前片段3.8k载体3k，双酶切折腾了三个月连不上，一步克隆做了一次两天搞定。

我是本科实习新手，求教一部克隆是什么

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28楼2017-06-02 12:50:24
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我好暴躁啊

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
15楼: Originally posted by wangxiaoguo at 2017-05-31 22:15:16
第二，酶切和连接时间最好长一些。一般双酶切出现假阳性的话，很可能是酶切不是很完全。如果两个酶位点太近的话会有位置效应的。另外，确认一下你检测的引物是唯一的。要不可能会出现扩增的并不是目的片段长度，但实 ...

谢谢你，

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29楼2017-06-02 12:51:59
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贱贱JMe

木虫 (小有名气)

教导主任

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体少加，片段多加，增加连接时间，增加挑斑数量。尽量让载体酶切完全

网上查一查，有个优化方案是先把载体和片段加到一起，多少度处理一段时间，再加酶，具体记不清楚。

去磷酸化是平末端连接载体需要处理的，黏性一般不需要，可以试试，网上都可以查到，有专门的试剂。
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想做一位科研好人
30楼2017-06-02 14:47:22
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