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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切连接不成功
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我好暴躁啊

新虫 (小有名气)

[求助] 双酶切连接不成功 已有7人参与

双酶切连接这么难吗，怎么就连不上！目的片段3300，载体3000，酶是NEB的。,双酶切后10ulT4连接体系，体积比设了好几个，转化子长了好多，挑菌，菌液PCR都是假阳性，欲哭无泪( ˙-˙ )，该怎么办？

双酶切连接不成功


双酶切连接不成功-1


双酶切连接不成功-2


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1楼 2017-05-30 21:44:31
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蓝马追风

新虫 (小有名气)
1、确定确实切开了(片段如果PCR扩增得到，没加保护碱基，酶切效率是很低的)；2、连接时，片段和载体摩尔比控制在5-10；3、只用菌落PCR可能没鉴定出来。实在不行可以先连T载，再切

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22楼2017-06-02 00:18:38
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macroH
顶

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2楼2017-05-30 22:01:09
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luoyl210

新虫 (著名写手)
我们一般克隆的假阳性比较多，亚克隆不太会出现假阳性

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3楼2017-05-30 22:13:28
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-30 22:40:29
包给我做吧~~~呵呵。大片段本身就不太好连，另外，你酶切位点没有选紧邻的两个吧。。那样可能切不开哈。。然后，你回收片段关注下260/230，最好2左右，最差也要大于1.5，要么成功率会很低。
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4楼2017-05-30 22:32:27
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