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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切连接不成功
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xuexikuang


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11楼2017-05-31 09:18:58
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铭记于心2222

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by 铭记于心2222 at 2017-05-30 22:48:06
确保酶切效果，去磷酸化效果，连接体系，跑胶可以看看哦，别切碎了  做对照看看哪步出问题了

酶切之后不加基因加t4过夜，可以验证你双酶切彻底不；不加t4，按理说菌不会长的，长了说明质粒没切开。双酶切做时间梯度，时间长了没事就多切会等等

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12楼2017-05-31 15:09:49
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wangxiaoguo

木虫 (正式写手)
第一确保双酶切切开了。可以先逐次单酶切。t

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202010
13楼2017-05-31 22:10:42
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wangxiaoguo

木虫 (正式写手)
t4连接看是否长，如果长的话，说明酶切不完全。

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202010
14楼2017-05-31 22:11:37
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wangxiaoguo

木虫 (正式写手)
第二，酶切和连接时间最好长一些。一般双酶切出现假阳性的话，很可能是酶切不是很完全。如果两个酶位点太近的话会有位置效应的。另外，确认一下你检测的引物是唯一的。要不可能会出现扩增的并不是目的片段长度，但实际上确连好了

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我好暴躁啊
202010
15楼2017-05-31 22:15:16
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111sst

新虫 (初入文坛)
这是什么菌啊

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16楼2017-06-01 13:02:42
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司空呆呆

新虫 (小有名气)
你的载体有点小，换一个7000左右的，很好链接的。

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17楼2017-06-01 13:41:34
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
大片段不好连接，效率低，但是还是有阳性的。我的问题是重组质粒超过10 kb，很难转化进去，加上重组效率低筛不到目的菌。
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18楼2017-06-01 16:05:37
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我好暴躁啊

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 111sst at 2017-06-01 13:02:42
这是什么菌啊

DH5α

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19楼2017-06-01 17:07:09
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lusandanooo

银虫 (小有名气)
用一部克隆吧，就国产的，好用的不行，我之前片段3.8k载体3k，双酶切折腾了三个月连不上，一步克隆做了一次两天搞定。

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毕了业真开心嘻嘻嘻嘻嘻
20楼2017-06-01 20:58:47
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