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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 求助！！！双酶切连接不上这是为什么
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薇筱123

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助！！！双酶切连接不上这是为什么 已有7人参与

实验想要让一个7000左右bp的质粒载体变小一点，所以用Kpn1和Not1双酶切，切下一个400bp左右的片段，跑胶，但是看不到400bp的条带，然后In-fusion连上一个20bp左右的片段，然后转化，涂板子，都不长菌，这是说明我的双酶切没成功还是没有连上那个20bp的片段，我要怎样改进实验呢？求指导！都重复实验好几次了，都成功不了啊！
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1楼 2015-10-14 10:12:18
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-15 18:11:32
你这描述的就是不想让别人能帮得上忙的样子。。。。
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2楼2015-10-15 01:31:57
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tolobio

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-15 18:12:21
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仅供参考！
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9楼2015-10-15 12:29:11
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普通回帖

thetc

木虫 (小有名气)
★
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2015-10-15 18:11:39
查一下你那2个酶的最适条件，把你实验的条件调整调整把。

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加入，希望能学习多一点
3楼2015-10-15 07:35:22
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厚德求是

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-15 18:11:54
转化不成功的原因可能有非常多，连接酶的效率，反应的条件，感受态的效率，抗性的选择。建议设立对照组，逐一排查上述问题。

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4楼2015-10-15 07:42:19
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ocean_of_yu

木虫 (正式写手)

Cool

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉你的酶切就有问题，优化酶切体系和条件，确认一下是不是质粒和目的基因上都有相同的酶切位点～

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5楼2015-10-15 07:53:41
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jianguochen

新虫 (小有名气)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-15 18:12:38
感觉比较奇怪.如果双酶切下400bp的条带的话，那么电泳上不应该看不出来。如果没有酶切成功，用的质粒去做连接转化，那质粒的转化效率应该是比较高的。可以用纯质粒做一次转化，看看能不能转化成功。
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6楼2015-10-15 09:16:43
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liping121200

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-15 18:12:29
首先，你双酶切跑电泳没有400bp条带，基本是证明你酶切不成功，就更不要提后面的连接了，你把你的酶切条件展示出来给大伙看看，让大家给你分析分析，利于你一步一步把问题解决了。
再者，你的目的片段只有20bp，片段酶切位点都加上了吗
哪怕是连接不成功，空载体转入到感受态细胞，也能长出菌的吧，估计你的感受态也可能有问题。
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好好学习，天天向上
7楼2015-10-15 09:43:56
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15853830932

木虫 (小有名气)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-15 18:13:03
我也做infusion，不知道你的marker跑的亮不亮。亮度要看核酸大小，400bp太小了，不一定能看出来。你酶切完后可以直接化转，看看效率如何。证明酶切是否成功。然后再做infusion。你用的哪家公司的？酶切完回收了吗？

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If you shed tear when you miss the sun, you also miss the stars.
8楼2015-10-15 09:46:51
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薇筱123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 15853830932 at 2015-10-15 09:46:51
我也做infusion，不知道你的marker跑的亮不亮。亮度要看核酸大小，400bp太小了，不一定能看出来。你酶切完后可以直接化转，看看效率如何。证明酶切是否成功。然后再做infusion。你用的哪家公司的？酶切完回收了吗？
...

做了转化也没有成功，长的都是background,不是我构建的质粒
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10楼2015-10-15 13:59:06
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